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【摘 要】目的：研究顺铂在体外是否可以选择性诱导9L胶质瘤细胞凋亡，而对正常神经胶质细胞生长影响较小。方法：應用不同浓度顺铂分别处理9L胶质瘤细胞株及原代培养的正常鼠神经胶质细胞，以TUNEL检测两种细胞凋亡的形态变化。并用Annexin - v-FITC/PI双标记法上流式细胞仪检测两种细胞凋亡率。结果：经顺铂作用后，TUNEL法观察到9L胶质瘤细胞发生了显著的凋亡形态改变，而正常细胞几乎没有凋亡改变；运用Annexin-V-FITC/PI双标记法在流式细胞仪检测显示，在4μg/ml浓度的顺铂的作用下，正常细胞的凋亡率要明显小于9L胶质瘤细胞株。结论：顺铂在体外可显著抑制9L胶质瘤细胞株生长，但顺铂对正常神经胶质细胞生长的抑制作用较弱，提示顺铂抑制细胞生长的作用具有一定的选择性。
【关键词】顺铂；9L胶质瘤细胞；细胞凋亡
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0039—02
本实验在体外研究了顺铂对9L胶质瘤细胞的促凋亡作用，同时根据实验提示，在治疗浓度时，对正常神经胶质瘤细胞影响较小。这为我们临床应用顺铂等化疗药物治疗颅内胶质瘤提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系：大鼠9L胶质瘤细胞；原代正常神经胶质细胞（从新生乳鼠脑灰质部分培养获得）。
1.2 实验试剂及设备：DMEM、胎牛血清，胰蛋白酶，Annexin V-FITC Kit，原位末端标记检测试剂盒。倒置相差显微镜，超净台、CO2培养箱，高速离心机，流式细胞仪。
1.3 神经胶质细胞的原代培养[1，2]：无菌条件下取新生的Wistar乳鼠的脑组织，胰酶消化成单细胞，放入孵箱中培养并传代。
1.4 9L胶质瘤细胞培养：用细胞培养方法常规的传代培养。
1.5 TUNEL检测凋亡[3] ：9L胶质瘤细胞按105个.mL-1密度接种于六孔培养板中，加入顺铂（4μg/ml），对照组不加药，72h后用4%多聚甲醛固定，0.3 %甲醇H2O2处理。光镜下观察，结果判定：细胞中有棕黄色颗粒者，为阳性细胞。
1.6 流式细胞术测定法：细胞培养方法同上，给予4μg/ml的顺铂处理，72h后用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤离心。将细胞悬浮于200μL的PI，避光室温反应15min。加入300μL结合缓冲液，立即上流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 利用倒置显微镜下观察正常传代培养的9L胶质瘤细胞和传至第四代的原代神经胶质细胞，如图 （1）。
2.2 原位末端标记法检测：经顺铂作用的正常神经细胞内未见棕褐色颗粒（图2A）9L胶质瘤细胞内可见棕褐色颗粒（图2B）。
2.3 Annexin-v-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡：如图3所示，所得结果经SPSS13.0统计软件分析，经在4μg/ml的顺铂处理72小时后，9L细胞的凋亡率为（ ）：15.62±0.38；正常神经细胞的凋亡率为（ ）：2.56±0.25。经t检验 t=61.273，P<0.001，差别具有统计学意义。
3 讨论
目前的研究表明：胶质瘤发病率占颅内肿瘤的44%[4]，其死亡率极高。术后易复发。目前还无有效地治疗手段。找到适合的化疗药物及合理治疗浓度是我们所要追求的结果。顺铂可用于恶性胶质瘤化疗并可诱导其凋亡。顺铂的诱导凋亡主要使Bax基因表达增高[5]，因Bax与Bcl-2的比值增大导致细胞对任何诱导凋亡的刺激变为敏感，更易出现凋亡[6]。那么可以最大程度杀伤肿瘤细胞而最低程度影响正常神经细胞就是本实验研究所解决的关键问题。
本实验在基础上研究了顺铂对质瘤细胞和正常神经细胞的促凋亡作用是否相同。TUNEL形态学观察结果可见，顺铂处理后的9L胶质瘤细胞株发生明显的凋亡形态学改变，而正常神经胶质细胞凋亡改变少见。本实验Annexin-v-FITC/PI双标记法流式细胞仪结果显示9L胶质瘤细胞4μmol/ml顺铂作用72小时下，凋亡率明显高于正常神经胶质细胞。通过以上实验说明顺铂促凋亡作用具有一定的选择性。
本实验发现，顺铂在诱导9L胶质瘤细胞明显凋亡的同时对正常神经胶质细胞的生长抑制及促凋亡作用较小，因此可为临床治疗神经系统肿瘤提供实验室依据，即应用顺铂治疗胶质瘤时，在合理有效的治疗浓度下可有效杀伤肿瘤细胞，而对正常脑细胞影响较小。
参考文献：
[1] Olive PL ， Wlodek D， Banath JP. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis [J]. Cancer Res， 1991， 51（17）：4671-4676
[2] Cichon J， Sun C， Chen B ， et al.. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem 2012； 287（6）： 3919–3929.
[3] Labat-Moleur F， Guillenn et G， Lorimier P， et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections： critical evaluation and provement critical evaluation and improvement[J].J Histochem Cytochem， 1998，46（3）： 327-334
[4] 王忠诚.神经外科学[M].武汉：湖北科学技术出版社，2005： 512
[5] Zeng SY，Li LY，Shu KY，et al. Chemoradiotherapy versus Radiotherapy in Advanced Cervical Carcinoma[J]. Ai Zheng，2008， 27（ 9） ： 942.
[6] Arthur Taylor，Yulia Krupskaya，Kai Kramer.Cisplatin -loaded carbon-encapsulated iron nanoparticles and their in vitro effects in magneticfluid hyperthermia [J]Carbon，2010，48 （8）：2327-2334.
【关键词】顺铂；9L胶质瘤细胞；细胞凋亡
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0039—02
本实验在体外研究了顺铂对9L胶质瘤细胞的促凋亡作用，同时根据实验提示，在治疗浓度时，对正常神经胶质瘤细胞影响较小。这为我们临床应用顺铂等化疗药物治疗颅内胶质瘤提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系：大鼠9L胶质瘤细胞；原代正常神经胶质细胞（从新生乳鼠脑灰质部分培养获得）。
1.2 实验试剂及设备：DMEM、胎牛血清，胰蛋白酶，Annexin V-FITC Kit，原位末端标记检测试剂盒。倒置相差显微镜，超净台、CO2培养箱，高速离心机，流式细胞仪。
1.3 神经胶质细胞的原代培养[1，2]：无菌条件下取新生的Wistar乳鼠的脑组织，胰酶消化成单细胞，放入孵箱中培养并传代。
1.4 9L胶质瘤细胞培养：用细胞培养方法常规的传代培养。
1.5 TUNEL检测凋亡[3] ：9L胶质瘤细胞按105个.mL-1密度接种于六孔培养板中，加入顺铂（4μg/ml），对照组不加药，72h后用4%多聚甲醛固定，0.3 %甲醇H2O2处理。光镜下观察，结果判定：细胞中有棕黄色颗粒者，为阳性细胞。
1.6 流式细胞术测定法：细胞培养方法同上，给予4μg/ml的顺铂处理，72h后用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤离心。将细胞悬浮于200μL的PI，避光室温反应15min。加入300μL结合缓冲液，立即上流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 利用倒置显微镜下观察正常传代培养的9L胶质瘤细胞和传至第四代的原代神经胶质细胞，如图 （1）。
2.2 原位末端标记法检测：经顺铂作用的正常神经细胞内未见棕褐色颗粒（图2A）9L胶质瘤细胞内可见棕褐色颗粒（图2B）。
2.3 Annexin-v-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡：如图3所示，所得结果经SPSS13.0统计软件分析，经在4μg/ml的顺铂处理72小时后，9L细胞的凋亡率为（ ）：15.62±0.38；正常神经细胞的凋亡率为（ ）：2.56±0.25。经t检验 t=61.273，P<0.001，差别具有统计学意义。
3 讨论
目前的研究表明：胶质瘤发病率占颅内肿瘤的44%[4]，其死亡率极高。术后易复发。目前还无有效地治疗手段。找到适合的化疗药物及合理治疗浓度是我们所要追求的结果。顺铂可用于恶性胶质瘤化疗并可诱导其凋亡。顺铂的诱导凋亡主要使Bax基因表达增高[5]，因Bax与Bcl-2的比值增大导致细胞对任何诱导凋亡的刺激变为敏感，更易出现凋亡[6]。那么可以最大程度杀伤肿瘤细胞而最低程度影响正常神经细胞就是本实验研究所解决的关键问题。
本实验在基础上研究了顺铂对质瘤细胞和正常神经细胞的促凋亡作用是否相同。TUNEL形态学观察结果可见，顺铂处理后的9L胶质瘤细胞株发生明显的凋亡形态学改变，而正常神经胶质细胞凋亡改变少见。本实验Annexin-v-FITC/PI双标记法流式细胞仪结果显示9L胶质瘤细胞4μmol/ml顺铂作用72小时下，凋亡率明显高于正常神经胶质细胞。通过以上实验说明顺铂促凋亡作用具有一定的选择性。
本实验发现，顺铂在诱导9L胶质瘤细胞明显凋亡的同时对正常神经胶质细胞的生长抑制及促凋亡作用较小，因此可为临床治疗神经系统肿瘤提供实验室依据，即应用顺铂治疗胶质瘤时，在合理有效的治疗浓度下可有效杀伤肿瘤细胞，而对正常脑细胞影响较小。
参考文献：
[1] Olive PL ， Wlodek D， Banath JP. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis [J]. Cancer Res， 1991， 51（17）：4671-4676
[2] Cichon J， Sun C， Chen B ， et al.. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem 2012； 287（6）： 3919–3929.
[3] Labat-Moleur F， Guillenn et G， Lorimier P， et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections： critical evaluation and provement critical evaluation and improvement[J].J Histochem Cytochem， 1998，46（3）： 327-334
[4] 王忠诚.神经外科学[M].武汉：湖北科学技术出版社，2005： 512
[5] Zeng SY，Li LY，Shu KY，et al. Chemoradiotherapy versus Radiotherapy in Advanced Cervical Carcinoma[J]. Ai Zheng，2008， 27（ 9） ： 942.
[6] Arthur Taylor，Yulia Krupskaya，Kai Kramer.Cisplatin -loaded carbon-encapsulated iron nanoparticles and their in vitro effects in magneticfluid hyperthermia [J]Carbon，2010，48 （8）：2327-2334.