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摘要 [目的] 研究中草药红茶菌的细胞、乳鼠毒性以及对口蹄疫病毒在体外的抗病毒活性。[方法] 将中草药红茶菌过滤，用细胞培养液稀释，分别接种在BHK21细胞上观察细胞生长情况，评价其对细胞的毒性作用。将中草药红茶菌用灭菌水稀释，分别接种3日龄乳鼠，观察乳鼠生长、健康状态和接种部位变化情况，评价其对乳鼠的毒性作用。用稀释的中草药红茶菌与浓度为1 000 LD50的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃条件下作用30 min，接种3日龄乳鼠，观察乳鼠发病死亡情况，估算中草药红茶菌体外可杀灭口蹄疫病毒的最大使用浓度。用稀释的中草药红茶菌与口蹄疫病毒混合，接种BHK21细胞，观察致细胞病变效应，记录不同稀释度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒的杀灭效果。[结果]BHK21细胞和乳鼠试验表明，中草药红茶菌在1 ∶4稀释后，对BHK21细胞无毒性反应，并可有效抑制1 000 TCID50 口蹄疫病毒在BHK21细胞生长繁殖；1 ∶2稀释的红茶菌微生态制剂对3日龄乳鼠无毒性反应，并可有效杀灭1 000 LD50口蹄疫病毒。[结论] 中草药红茶菌是一种安全性好且对口蹄疫病毒有较好杀灭作用的口蹄疫预防中草药微生态制剂。
关键词 中草药红茶菌；口蹄疫病毒；预防；活性；体外
中图分类号 S852.65+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-05500-03
Abstract [Objective] To study the poisonous effects of Chinese herbal kombucha to cells and neonatl rat and its antiviral activity of FMDV in vitro. [Method] The filtered Chinese herbal Kombucha diluted with cell culture medium was inoculated in BHK21 cells， and its toxic effects on cells were observed and evaluated. The Chinese herbal Kombucha diluted with sterile water was inoculated with 3dayold suckling mice and its growth， health status and changes of vaccination site was observed， its toxic effects on suckling mice were evaluated. The diluted Chinese herbal kombuchaea is mixed with 1 000 LD50 of foot and mouth disease virus keeping for 30 min at 37 ℃， which is inoculated in 3dayold suckling to observe the incidence of neonatal mortality and estimate its maximum concentration of killing FMDV in vitro. The Chinese herbal kombucha mixed with FMDV is inoculated in BHK21 cells and its killing effects of FMDV are oberseved by recording cytopathic effects of different mixtures. [Result] BHK21 cells and suckling mouse tests showed： Chinese herbal Kombucha after 1 ∶4 dilution has no toxicity to BHK21 cells and could effectively inhibit the growth and reproduction of 1 000 TCID50 of FMDV in BHK21 cells； 1 ∶2 dilution of Chinese herbal kombucha has no toxicy on 3dayold suckling mice without toxicity and could effectively kill 1000 LD50 of FMDV. [Conclusion] Chinese herbal Kombucha is a safe and effective Chinese herbal probiotics for prevention and killing of FMDV.
Key words Chinese herbal Kombucha； FMD virus； Prevention； Aticity； in vitro
口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属（Family Picornaviridae，Genus Aphthovirus），它为正链RNA病毒；口蹄疫病毒在全世界可分为彼此无交叉保护反应的7个主型以及65个以上亚型[1]。 口蹄疫病毒感染偶蹄类动物造成口蹄疫疫情，这是一种急性、高度接触性传染病。虽然口蹄疫发病牲畜死亡率比较低，尤其是成年动物，但根据国际上控制口蹄疫的处理措施，对疫情发生地区将采取大规模扑杀以及贸易禁运，这些措施往往导致畜牧业大规模的经济损失。口蹄疫可以通过扑杀发病动物、禁止从口蹄疫疫区进口动物等卫生措施和使用疫苗来控制，但由于口蹄疫的高度传染性、包含野生动物在内的广泛宿主以及病原体众多的血清型使得口蹄疫防控变得困难[2]。这是因为口蹄疫病毒为RNA病毒，它的遗传信息在自然进化过程中变异很快[3-4]；甚至，在疫苗生产过程中，多次传代繁殖病毒制备疫苗，造成制苗种毒发生新的变异，导致最终疫苗种毒可能不能提供所需的抗原覆盖率[5]。因此，至今口蹄疫的预防依然是一个畜牧疫病研究的重要难题。 口蹄疫病毒对酸特别敏感[6-7]。根据口蹄疫病毒对酸的敏感性，研制出各种酸性消毒剂，通过喷雾消毒来预防口蹄疫。但这些消毒作用均是瞬时性的。消毒过后，外面的口蹄疫病毒依然可以通过呼吸道和消化道侵染易感动物。红茶菌是一种包含醋酸菌、酵母菌为主、产酸能力很强的共生菌群，它能在醋酸菌、酵母菌的共生作用下产生醋酸、柠檬酸、葡萄糖酸等酸性物质，红茶菌培养液pH一般保持在2.5～4.5[8]。红茶菌对人体胃肠道的保健机理之一就是依靠降低胃肠道的pH来抑制病原菌的生长[9] 。茶叶、罗汉果、甘草、野菊花是一些具有药食两用的中草药植物，这些植物的提取液普遍具有提高动物免疫力、拮抗病原细菌、病毒等方面的作用。因此，如果利用红茶菌发酵上述茶叶等提取液来制备微生态制剂，将这种中草药红茶菌喷入这些口蹄疫病毒易感动物的呼吸道和消化道，红茶菌中的复合菌群将通过产生醋酸等有机酸来降低这些口蹄疫病毒感染途径的pH，同时在茶叶等中草药提取液的协同作用下将能有效预防口蹄疫的发生。笔者在此报道了这种中草药红茶菌的制备、中草药红茶菌体外抗口蹄疫病毒活性以及临床应用预防口蹄疫的试验结果。
1 材料与方法
1.1 中草药红茶菌的制备以及检测
所用红茶菌菌种购自北京食品研究所。红茶菌母液的制备参考吕爱军等提供的方法[10]。制备中药提取液是将0.2%茶叶、0.5%甘草、0.2%罗汉果和0.2%野菊花放入水溶液中煮沸，过滤后冷却到约30 ℃以下时加入20%红茶菌母液，静置发酵2周后用于检测或临床使用。采用岛津分析重金属等离子发射光谱仪ICPS7510检测红中草药红茶菌中的重金属，它的醋酸菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌含量等指标采用常规的平板计数法检测，pH用FE20型pH计测量。
1.2 中草药红茶菌对BHK21细胞和乳鼠安全性试验
1.2.1 中草药红茶菌对BHK21细胞安全性试验。
BHK21细胞系，从中国兽医药品监察所引进，实验室传代保存；3日龄昆明系小白鼠（乳鼠），由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提 供。将中草药红茶菌在无菌环境下用微孔过滤器（0.22 μm）过滤后，用细胞培养液稀释成1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10等3个稀释度，与过滤后的原液共4组，分别接种生长良好的单层BHK21细胞，每个稀释度接种8孔，50 μl/孔，37 ℃恒温培养，观察细胞生长情况，评价其对细胞的毒性作用。阴性对照组直接接种细胞培养液。试验重复2次。
1.2.2 中草药红茶菌对乳鼠安全性试验。将中草药红茶菌用灭菌水稀释成1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10等3个稀释度，与未经任何处理的原液共4组，分别接种3日龄乳鼠，0.2 ml/只，每组接种5只，观察乳鼠生长、健康状态和接种部位变化情况，评价其对乳鼠的毒性作用。阴性对照组接种灭菌水。试验重复2次。
1.3 中草药红茶菌对口蹄疫病毒杀灭效果测定
1.3.1 中草药红茶菌杀灭口蹄疫病毒的预试验。口蹄疫病毒株O/China/99培养、扩繁、种子批制备等方法按照中国农业科学院兰州兽医研究所动物生物安全三级实验室《口蹄疫实验标准操作规程（SOP）》相关文件进行；毒价测定按照ReedMuench法进行。用1 ∶10、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000倍稀释的中草药红茶菌与浓度为1 000 LD50（LD50表示50%乳鼠致死的病毒剂量）的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃条件下作用30 min，接种3日龄乳鼠，0.2 ml/只，每组4只，观察乳鼠发病死亡情况，连续观察7 d。重复2次，估算中草药红茶菌体外可杀灭口蹄疫病毒的最大使用浓度。阳性对照为1 000 LD50稀释的病毒液，阴性对照为最低稀释度的中草药红茶菌。阳性对照应于48 h以内因口蹄疫病毒感染而全部致死，阴性对照应不出现任何不良反应。
1.3.2 BHK21细胞试验。结合细胞安全性试验和预试验，采用方阵交叉反应滴定法，选取2倍梯度稀释中草药红茶菌，与10倍梯度稀释的细胞毒等体积混合（每孔各加50 μl），37 ℃作用60 min，接种BHK21细胞，观察致细胞病变效应。同时设立100 TCID50、1 TCID50和0.1 TCID50（TCID50表示检测细胞50%致死的病毒剂量）的病毒回归对照各4孔，每孔加病毒液50 μl；中草药红茶菌每稀释度的细胞毒性对照各4孔，不加病毒液；正常细胞对照4孔，不加病毒液。连续观察72 h，100 TCID50孔应出现典型的细胞病变效应，0.1 TCID50和细胞毒性对照以及正常细胞对照均不出现细胞病变效应。重复3次，记录不同稀释度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒的杀灭效果。
1.3.3 乳鼠试验。结合乳鼠安全性试验和预试验，选取适当稀释度中草药红茶菌与1 000 LD50的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃条件下作用30 min，接种3日龄乳鼠，0.2 ml/只，每组4只，观察乳鼠发病死亡情况，连续观察7 d。重复3次，计算中草药红茶菌体外可杀灭口蹄疫病毒的最大浓度。阳性对照为1 000 LD50稀释的病毒液，阴性对照为最低稀释度的中草药红茶菌。阳性对照应于48 h以内因口蹄疫病毒感染而全部致死，阴性对照应不出现任何不良反应。
2 结果与分析
2.1 中草药红茶菌的制备以及检测
经过上述制备工艺，获得中草药红茶菌，该产品的各项检测指标如表1所示。从表1可以看出，中草药红茶菌具有很强的酸性（pH=2.75），表明红茶菌具有很强的产酸特性；由于中草药红茶菌既包含茶叶、羅汉果、甘草等提取液和益生生菌的成分，茶叶等提取液的成分对醋酸菌、酵母等有抑制作用，所以益生菌含量偏低；中草药红茶菌其他各项目指标如重金属指标、杂菌指标是合格的，没有病原菌沙门氏菌的检出。
2.2 中草药红茶菌安全性试验结果 按照ReedMuench法測定，试验用毒株对乳鼠半数致死量（LD50）为10-8.0/0.2ml，对细胞毒半数感染量（TCID50）为10-7.0/50 μl。
经过滤中草药红茶菌原液、1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10稀释液，分别接种单层BHK21细胞后，24 h观察到原液和1 ∶2稀释液接种的细胞100%死亡，1 ∶4和1 ∶10稀释液接种的细胞正常生长，未见细胞毒性反应；重复2次结果一致。由此可见，中草药红茶菌经1 ∶4稀释或更高倍数稀释后，接种BHK21细胞，对细胞无毒性反应。从中草药红茶菌对乳鼠安全性试验结果（表2）可以看出，乳鼠在接种中草药红茶菌原液后，肉眼可见微弱毒性反应；在接种1 ∶2及更高稀释度后，乳鼠全部健活，表现为安全。
3 讨论
红茶菌是一个以醋酸菌、酵母菌为主的复合共生菌群，因此，相对于单一的菌种或非共生的菌群，它具有很强的存活能力；由于它能产生乙酸、葡萄糖酸、乳酸等有机酸类物质，因此具有很强的拮抗其他病原微生物的能力，如红茶菌菌液能有效抑制枯草芽抱杆菌（ B.subgilis）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）以及幽门螺旋杆菌（H.pylori）等[9-10] 。 根据口蹄疫病毒对酸敏感的特性以及高浓度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒的抑制和杀灭试验结果，推测中草药红茶菌中的有机酸对口蹄疫病毒的杀灭应起到主效作用，同时也与广谱性的抗病毒植物茶叶、甘草、罗汉果等的提取液有关，如其中的甘草提取液中的甘草多糖可以刺激细胞产生干扰素来提高动物机体的抗病毒特性[11-12]。
笔者以前在猪上的口喷和鼻喷中草药红茶菌的试验结果表明，使用一次中草药红茶菌，在一周之内，从猪的粪便中分离出大量醋酸菌。表明红茶菌中的醋酸菌和酵母复合共生菌群在猪的消化道中能存活能长达1周或更长的时间。 因此，可推测中草药红茶菌中的醋酸菌、酵母等益生菌在动物的呼吸道以及消化道存活较长时间，这些益生菌能够持续产生醋酸等有机酸来抑制和杀灭口蹄疫病毒，从而实现对口蹄疫相对较为长效的预防。由于这种有效预防时间仅为1～2周的时间，所以需要周期性（如每周一次）使用这种中草药红茶菌，才能实现对口蹄疫的长效预防。除了抗口蹄疫病毒的特性，这种中草药红茶菌具有一般微生态制剂的优良特性，如无毒、环保、促进生长、提高动物的免役力等优良特性，因此这种多功能性将有助于促进这种中草药红茶菌在生产中的推广和应用。由于目前尚无醋酸菌、酵母共生菌群在猪、牛等动物呼吸道存活时间的相关研究数据，进一步的相关研究将揭开中草药红茶菌对口蹄疫高效预防的作用机理。 利用中草药红茶菌预防口蹄疫，可以立即生效，无任何迟滞期。因此，除了平时使用预防外，还可以用于对口蹄疫疫区的应激性预防。最近有报道称注射干扰素表达载体可以有效预防口蹄疫，但这种方法最短也有24 h的迟滞期，而且平时也不可能经常性的注射这种病毒载体[13-14] 。
参考文献
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安徽农业科学 2014年
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[11] 王彦芳，秦林，王焱，等.中药抗病毒研究进展[J].中医中药，2008，14（22）：3488-3490.
[12] 苏俊喜，周颖，门文军，等.甘草有效成分应用的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2010，31（8）：111-113.
[13] CHINSANGARAM J，KOSTER M，GRUBMAN M J.Inhibiton of Ldeleted footandmouth disease virus replification by alpHa/beta interferonInvolves doublestranded RNAdependent protein kinase[J].J Virol，2011，12：5498-5503.
[14] CHINSANGARAM J，MORAES P M，KOSTER M，et al.Novel viral disease control strategy：Adenovirus exepressing alpHa interferon rapidly protects swine from footandmouth disease[J].J Virol，2003，77（2）：1621-1625.
关键词 中草药红茶菌；口蹄疫病毒；预防；活性；体外
中图分类号 S852.65+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）17-05500-03
Abstract [Objective] To study the poisonous effects of Chinese herbal kombucha to cells and neonatl rat and its antiviral activity of FMDV in vitro. [Method] The filtered Chinese herbal Kombucha diluted with cell culture medium was inoculated in BHK21 cells， and its toxic effects on cells were observed and evaluated. The Chinese herbal Kombucha diluted with sterile water was inoculated with 3dayold suckling mice and its growth， health status and changes of vaccination site was observed， its toxic effects on suckling mice were evaluated. The diluted Chinese herbal kombuchaea is mixed with 1 000 LD50 of foot and mouth disease virus keeping for 30 min at 37 ℃， which is inoculated in 3dayold suckling to observe the incidence of neonatal mortality and estimate its maximum concentration of killing FMDV in vitro. The Chinese herbal kombucha mixed with FMDV is inoculated in BHK21 cells and its killing effects of FMDV are oberseved by recording cytopathic effects of different mixtures. [Result] BHK21 cells and suckling mouse tests showed： Chinese herbal Kombucha after 1 ∶4 dilution has no toxicity to BHK21 cells and could effectively inhibit the growth and reproduction of 1 000 TCID50 of FMDV in BHK21 cells； 1 ∶2 dilution of Chinese herbal kombucha has no toxicy on 3dayold suckling mice without toxicity and could effectively kill 1000 LD50 of FMDV. [Conclusion] Chinese herbal Kombucha is a safe and effective Chinese herbal probiotics for prevention and killing of FMDV.
Key words Chinese herbal Kombucha； FMD virus； Prevention； Aticity； in vitro
口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属（Family Picornaviridae，Genus Aphthovirus），它为正链RNA病毒；口蹄疫病毒在全世界可分为彼此无交叉保护反应的7个主型以及65个以上亚型[1]。 口蹄疫病毒感染偶蹄类动物造成口蹄疫疫情，这是一种急性、高度接触性传染病。虽然口蹄疫发病牲畜死亡率比较低，尤其是成年动物，但根据国际上控制口蹄疫的处理措施，对疫情发生地区将采取大规模扑杀以及贸易禁运，这些措施往往导致畜牧业大规模的经济损失。口蹄疫可以通过扑杀发病动物、禁止从口蹄疫疫区进口动物等卫生措施和使用疫苗来控制，但由于口蹄疫的高度传染性、包含野生动物在内的广泛宿主以及病原体众多的血清型使得口蹄疫防控变得困难[2]。这是因为口蹄疫病毒为RNA病毒，它的遗传信息在自然进化过程中变异很快[3-4]；甚至，在疫苗生产过程中，多次传代繁殖病毒制备疫苗，造成制苗种毒发生新的变异，导致最终疫苗种毒可能不能提供所需的抗原覆盖率[5]。因此，至今口蹄疫的预防依然是一个畜牧疫病研究的重要难题。 口蹄疫病毒对酸特别敏感[6-7]。根据口蹄疫病毒对酸的敏感性，研制出各种酸性消毒剂，通过喷雾消毒来预防口蹄疫。但这些消毒作用均是瞬时性的。消毒过后，外面的口蹄疫病毒依然可以通过呼吸道和消化道侵染易感动物。红茶菌是一种包含醋酸菌、酵母菌为主、产酸能力很强的共生菌群，它能在醋酸菌、酵母菌的共生作用下产生醋酸、柠檬酸、葡萄糖酸等酸性物质，红茶菌培养液pH一般保持在2.5～4.5[8]。红茶菌对人体胃肠道的保健机理之一就是依靠降低胃肠道的pH来抑制病原菌的生长[9] 。茶叶、罗汉果、甘草、野菊花是一些具有药食两用的中草药植物，这些植物的提取液普遍具有提高动物免疫力、拮抗病原细菌、病毒等方面的作用。因此，如果利用红茶菌发酵上述茶叶等提取液来制备微生态制剂，将这种中草药红茶菌喷入这些口蹄疫病毒易感动物的呼吸道和消化道，红茶菌中的复合菌群将通过产生醋酸等有机酸来降低这些口蹄疫病毒感染途径的pH，同时在茶叶等中草药提取液的协同作用下将能有效预防口蹄疫的发生。笔者在此报道了这种中草药红茶菌的制备、中草药红茶菌体外抗口蹄疫病毒活性以及临床应用预防口蹄疫的试验结果。
1 材料与方法
1.1 中草药红茶菌的制备以及检测
所用红茶菌菌种购自北京食品研究所。红茶菌母液的制备参考吕爱军等提供的方法[10]。制备中药提取液是将0.2%茶叶、0.5%甘草、0.2%罗汉果和0.2%野菊花放入水溶液中煮沸，过滤后冷却到约30 ℃以下时加入20%红茶菌母液，静置发酵2周后用于检测或临床使用。采用岛津分析重金属等离子发射光谱仪ICPS7510检测红中草药红茶菌中的重金属，它的醋酸菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌含量等指标采用常规的平板计数法检测，pH用FE20型pH计测量。
1.2 中草药红茶菌对BHK21细胞和乳鼠安全性试验
1.2.1 中草药红茶菌对BHK21细胞安全性试验。
BHK21细胞系，从中国兽医药品监察所引进，实验室传代保存；3日龄昆明系小白鼠（乳鼠），由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提 供。将中草药红茶菌在无菌环境下用微孔过滤器（0.22 μm）过滤后，用细胞培养液稀释成1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10等3个稀释度，与过滤后的原液共4组，分别接种生长良好的单层BHK21细胞，每个稀释度接种8孔，50 μl/孔，37 ℃恒温培养，观察细胞生长情况，评价其对细胞的毒性作用。阴性对照组直接接种细胞培养液。试验重复2次。
1.2.2 中草药红茶菌对乳鼠安全性试验。将中草药红茶菌用灭菌水稀释成1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10等3个稀释度，与未经任何处理的原液共4组，分别接种3日龄乳鼠，0.2 ml/只，每组接种5只，观察乳鼠生长、健康状态和接种部位变化情况，评价其对乳鼠的毒性作用。阴性对照组接种灭菌水。试验重复2次。
1.3 中草药红茶菌对口蹄疫病毒杀灭效果测定
1.3.1 中草药红茶菌杀灭口蹄疫病毒的预试验。口蹄疫病毒株O/China/99培养、扩繁、种子批制备等方法按照中国农业科学院兰州兽医研究所动物生物安全三级实验室《口蹄疫实验标准操作规程（SOP）》相关文件进行；毒价测定按照ReedMuench法进行。用1 ∶10、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000倍稀释的中草药红茶菌与浓度为1 000 LD50（LD50表示50%乳鼠致死的病毒剂量）的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃条件下作用30 min，接种3日龄乳鼠，0.2 ml/只，每组4只，观察乳鼠发病死亡情况，连续观察7 d。重复2次，估算中草药红茶菌体外可杀灭口蹄疫病毒的最大使用浓度。阳性对照为1 000 LD50稀释的病毒液，阴性对照为最低稀释度的中草药红茶菌。阳性对照应于48 h以内因口蹄疫病毒感染而全部致死，阴性对照应不出现任何不良反应。
1.3.2 BHK21细胞试验。结合细胞安全性试验和预试验，采用方阵交叉反应滴定法，选取2倍梯度稀释中草药红茶菌，与10倍梯度稀释的细胞毒等体积混合（每孔各加50 μl），37 ℃作用60 min，接种BHK21细胞，观察致细胞病变效应。同时设立100 TCID50、1 TCID50和0.1 TCID50（TCID50表示检测细胞50%致死的病毒剂量）的病毒回归对照各4孔，每孔加病毒液50 μl；中草药红茶菌每稀释度的细胞毒性对照各4孔，不加病毒液；正常细胞对照4孔，不加病毒液。连续观察72 h，100 TCID50孔应出现典型的细胞病变效应，0.1 TCID50和细胞毒性对照以及正常细胞对照均不出现细胞病变效应。重复3次，记录不同稀释度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒的杀灭效果。
1.3.3 乳鼠试验。结合乳鼠安全性试验和预试验，选取适当稀释度中草药红茶菌与1 000 LD50的口蹄疫病毒等量混合，37 ℃条件下作用30 min，接种3日龄乳鼠，0.2 ml/只，每组4只，观察乳鼠发病死亡情况，连续观察7 d。重复3次，计算中草药红茶菌体外可杀灭口蹄疫病毒的最大浓度。阳性对照为1 000 LD50稀释的病毒液，阴性对照为最低稀释度的中草药红茶菌。阳性对照应于48 h以内因口蹄疫病毒感染而全部致死，阴性对照应不出现任何不良反应。
2 结果与分析
2.1 中草药红茶菌的制备以及检测
经过上述制备工艺，获得中草药红茶菌，该产品的各项检测指标如表1所示。从表1可以看出，中草药红茶菌具有很强的酸性（pH=2.75），表明红茶菌具有很强的产酸特性；由于中草药红茶菌既包含茶叶、羅汉果、甘草等提取液和益生生菌的成分，茶叶等提取液的成分对醋酸菌、酵母等有抑制作用，所以益生菌含量偏低；中草药红茶菌其他各项目指标如重金属指标、杂菌指标是合格的，没有病原菌沙门氏菌的检出。
2.2 中草药红茶菌安全性试验结果 按照ReedMuench法測定，试验用毒株对乳鼠半数致死量（LD50）为10-8.0/0.2ml，对细胞毒半数感染量（TCID50）为10-7.0/50 μl。
经过滤中草药红茶菌原液、1 ∶2、1 ∶4、1 ∶10稀释液，分别接种单层BHK21细胞后，24 h观察到原液和1 ∶2稀释液接种的细胞100%死亡，1 ∶4和1 ∶10稀释液接种的细胞正常生长，未见细胞毒性反应；重复2次结果一致。由此可见，中草药红茶菌经1 ∶4稀释或更高倍数稀释后，接种BHK21细胞，对细胞无毒性反应。从中草药红茶菌对乳鼠安全性试验结果（表2）可以看出，乳鼠在接种中草药红茶菌原液后，肉眼可见微弱毒性反应；在接种1 ∶2及更高稀释度后，乳鼠全部健活，表现为安全。
3 讨论
红茶菌是一个以醋酸菌、酵母菌为主的复合共生菌群，因此，相对于单一的菌种或非共生的菌群，它具有很强的存活能力；由于它能产生乙酸、葡萄糖酸、乳酸等有机酸类物质，因此具有很强的拮抗其他病原微生物的能力，如红茶菌菌液能有效抑制枯草芽抱杆菌（ B.subgilis）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）以及幽门螺旋杆菌（H.pylori）等[9-10] 。 根据口蹄疫病毒对酸敏感的特性以及高浓度的中草药红茶菌对口蹄疫病毒的抑制和杀灭试验结果，推测中草药红茶菌中的有机酸对口蹄疫病毒的杀灭应起到主效作用，同时也与广谱性的抗病毒植物茶叶、甘草、罗汉果等的提取液有关，如其中的甘草提取液中的甘草多糖可以刺激细胞产生干扰素来提高动物机体的抗病毒特性[11-12]。
笔者以前在猪上的口喷和鼻喷中草药红茶菌的试验结果表明，使用一次中草药红茶菌，在一周之内，从猪的粪便中分离出大量醋酸菌。表明红茶菌中的醋酸菌和酵母复合共生菌群在猪的消化道中能存活能长达1周或更长的时间。 因此，可推测中草药红茶菌中的醋酸菌、酵母等益生菌在动物的呼吸道以及消化道存活较长时间，这些益生菌能够持续产生醋酸等有机酸来抑制和杀灭口蹄疫病毒，从而实现对口蹄疫相对较为长效的预防。由于这种有效预防时间仅为1～2周的时间，所以需要周期性（如每周一次）使用这种中草药红茶菌，才能实现对口蹄疫的长效预防。除了抗口蹄疫病毒的特性，这种中草药红茶菌具有一般微生态制剂的优良特性，如无毒、环保、促进生长、提高动物的免役力等优良特性，因此这种多功能性将有助于促进这种中草药红茶菌在生产中的推广和应用。由于目前尚无醋酸菌、酵母共生菌群在猪、牛等动物呼吸道存活时间的相关研究数据，进一步的相关研究将揭开中草药红茶菌对口蹄疫高效预防的作用机理。 利用中草药红茶菌预防口蹄疫，可以立即生效，无任何迟滞期。因此，除了平时使用预防外，还可以用于对口蹄疫疫区的应激性预防。最近有报道称注射干扰素表达载体可以有效预防口蹄疫，但这种方法最短也有24 h的迟滞期，而且平时也不可能经常性的注射这种病毒载体[13-14] 。
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