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摘要 [目的]應用DNA条形码鉴定技术对短柄五加等五加属植物进行研究，以弄清倒卵叶五加和短柄五加的物种关系。[方法]通过对馆藏标本与现地植物形态进行观测，采用通用引物 ITS2 和 psbA-trnH对采自陕甘宁地区的短柄五加等50个样本进行扩增后双向测序，并从GenBank数据库下载了五加属等相关植物的序列，分别通过ITS2 database或其序列注释，获得ITS2和psbA-trnH序列，随后进行BLAST比对鉴定分析;用MEGA 6.06软件对所得序列进行比对，分析变异位点，计算GC含量、种内和种间遗传距离，构建NJ系统发育树。[结果]ITS2 和 psbA-trnH 序列的 PCR 扩增和测序成功率均为100%;倒卵叶五加和短柄五加的植物形态、ITS2序列和psbA-trnH序列完全相同。ITS2 序列：短柄五加和糙叶五加仅有一个碱基的差异，蜀五加与藤五加序列相同;psbA-trnH 序列：短柄五加与糙叶五加的差异显著，短柄五加与蜀五加序列相同。[结论]同时使用ITS2、psbA-trnH这2个标记的DNA 条形码可以准确鉴别短柄五加等五加属植物;短柄五加与倒卵叶五加为同一种植物。
关键词 倒卵叶五加;短柄五加;基原鉴定;DNA条形码;ITS2;psbA-trnH
中图分类号 R 282.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）15-0166-07
Abstract [Objective]The molecular identification technique of DNA barcode was used to identify the species of several plants of Eleutherococcus Maxim. in order to understand the relationship between Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus obovatus . [Method]By observing the morphology of collection specimens and onsite plants， using universal primers ITS2 and psbAtrnH， 50 samples including Eleutherococcus brachypus collected from Shaanxi， Gansu and Ningxia were amplified and sequenced in both directions，and downloaded the sequence of Araliacea and other related plants from GenBank database， obtained ITS2 and psbAtrnH sequence through ITS2 database or its sequence annotation， and then performed BLAST comparison and identification analysis.MEGA 6.06 software was used to compare the obtained sequences， analyze the mutation sites， calculate the GC content， intra and interspecies genetic distance， and construct the NJ phylogenetic tree.[Result]The success rate of PCR amplification and sequencing of ITS2 and psbAtrnH was 100%.The plant morphology， ITS2 sequence and psbAtrnH sequence of Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus obovatus were identical. ITS2 sequence： Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus henryi had only one base difference， and the sequence of Eleutherococcus leucorrhizus var. setchuenensis was the same as that of Eleutherococcus leucorrhizus .The sequence of psbAtrnH： Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus henryi sequence were significantly different， and the sequence of Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus leucorrhizus var. setchuenensis was the same.[Conclusion]At the same time， using ITS2 and psbAtrnH genetic markers， DNA barcode technology can accurately identify the 4 species of Eleutherococcus Maxim.; E. brachypus and E. obovatus should be the same plant. Key words Eleutherococcus obovatus;Eleutherococcus brachypus ;Base source identification;DNA barcoding;ITS2（internal transcribed spacer 2 sequence）;psbAtrnH（psbAtrnH intergenic spacer sequence）
基金項目 陕西省科技统筹创新工程项目（2016KTTSSF 01-01-02）;陕西省咸阳市重大科技专项（2014K 01-17）。
作者简介 赵新礼（1961—），男，陕西扶风人，主任药师，从事中药资源与栽培及分子生物学研究。
收稿日期 2021-01-27
倒卵叶五加与著名的中药材刺五加具有相似的化学成分和药理作用[1-2]，倒卵叶五加与短柄五加两者分布区域重叠，植物形态高度相似，在其产区内均作为倒卵叶五加药材使用，究竟两者为同一种植物还是2种植物长期以来存在争议[3-5]。自20世纪80年代倒卵叶五加被开发以来，由于无节制的采集使资源量锐减，为保证用药的安全性和有效性，以及其野生抚育与栽培物种的准确性，有必要对该中药材的基原进行鉴定研究。
传统的中药材基原鉴定即依据其植物形态学和分类学原理，根据形态鉴别特征，确定到物种的生物学名，这种鉴定方式受到鉴定人员知识和经验等因素的影响，具有一定的局限性。DNA条形码技术是利用基因组中一段或几段公认的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，以自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的分子鉴定技术，可以对物种实现准确、快速、简便的鉴定，不受发育阶段、供试部位、环境条件等的限制，弥补了传统鉴定方法在这方面的不足。
陈士林等[6]通过对大量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究，建立以ITS2为核心、psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系，并将该方法纳入2015年版《中国药典》。ITS2序列是去除5.8S和28S rRNA基因序列的核糖体DNA序列间隔区，psbA-trnH序列是位于叶绿体编码光合系统D1蛋白的psbA基因和编码tRNA组氨酸的trnH基因之间的一段非编码区，两者均具有进化速率快、引物通用性好、片段足够短、易扩增与测序的优点，已广泛用于人参属[7]、忍冬属[8]、枸杞属[9]、益母草[10]、覆盆子[11]、商陆[12]、活血丹[13]、金叉石斛[14]等药材基原物种鉴定，五加皮[15]、竹节参[16]、当归[17]等中药材真伪鉴别，人参[18]、西洋参[18]、苍术[19]等中药材种子种苗的鉴定。
该研究采用植物形态鉴定与DNA条形码分子鉴定技术相结合，利用通用引物ITS2和psbA-trnH序列对五加属短柄五加等4种植物的50份标本进行鉴定分析，结合GenBank数据库中的近缘物种序列构建系统进化树，弄清倒卵叶五加和短柄五加间的物种关系，为倒卵叶五加药材DNA条形码鉴定方法的建立提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。
1.1.1.1 馆藏标本。西北农林科技大学和陕西中药研究所馆藏的倒卵叶五加和短柄五加标本。
1.1.1.2 现地调查。对陕西、甘肃、宁夏的16个区县进行五加资源野外调查、采集标本与分析样品（表1）。标本经西北农林科技大学吴振海高级实验师鉴定，现存放在陕西中药研究所标本室。
1.1.1.3 样品采集。每个区县选取2～4个五加居群，在每个居群内选取相距2 m以上的10个植株，每株采集嫩叶一片放入自封袋内，加入硅胶快速干燥。待叶片彻底干燥后存放于-40 ℃的冰箱中备用。
1.1.1.4 五加属等物种的ITS2和psbA-trnH序列。五加属等物种的ITS2和psbA-trnH序列均来源于GenBank数据库（表2）。
1.1.2 试剂。
DNA Marker、植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化）;Tris、EDTA、冰乙酸、琼脂糖等（西安海默生物）;DNA凝胶回收试剂盒（北京擎科新业生物）;Prime STAR HS DNA Polymerase（Takara，美国）。
1.1.3 仪器。
高速冷冻离心机（eppendorf 5810R，德国）;PCR扩增仪（Life，美国）;制冰机（IMS-50，西安仪创）;电泳仪（JUNYI-300，北京君意）;凝胶成像仪（SAGECREATION，北京赛智）;基因测序仪器（ABI 3730，美国）。
1.2 方法
1.2.1 植物标本鉴定。依照植物的形态特征，参考文献资料，按传统方法进行鉴定[4]。
1.2.2 DNA提取。用干净的剪刀将试样剪碎，混匀，称取适量，用植物基因组DNA提取试剂盒依照说明书提取，提取液 -20 ℃ 保存。
1.2.3 引物。参见《中药DNA条形码分子鉴定》[20]，由北京擎科新业生物技术有限公司合成（表3）。
1.2.4 PCR扩增及测序。
1.2.4.1 扩增体系。DNA模板1 μL，5X Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，引物1与引物2各1 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 14.75 μL补足至 25 μL。
1.2.4.2 扩增程序。94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 35 s，33 个循环;72 ℃ 5 min，16 ℃停止。
1.2.4.3 PCR产物电泳及DNA纯化回收。PCR产物经15%的琼脂糖凝胶电泳后将目的片段割胶，并使用DNA凝胶回收试剂盒按说明书进行DNA片段的纯化回收。
1.2.4.4
DNA序列的测序。將纯化的产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。
1.3 数据处理
用Chromas软件对测序所得到的峰图进行人工校对;用CodonCode Aligner V6.0.2软件进行拼接。ITS2序列基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法采用ITS2 database网站（http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/）进行序列注释，去除两端的5.8S rRNA和28S rRNA区段，获得完整的ITS2序列。根据GenBank数据库中同属物种psbA-trnH的注释，去除序列两端的psbA和trnH基因，获得完整的psbA-trnH基因间隔区序列。用MEGA 6.06软件进行序列对比，分析变异位点，计算GC含量，用Kimura 2-Parameter（K2P）法将所有数据计算种内和种间遗传距离，用NJ邻接法（Neighbour 2 Joining Method，NJ）将比对过的序列分别构建成五加属植物的ITS2、pbsA-trnH序列的系统发育树，各个分支的支持率使用bootstrap重复1 000次进行检验。最终将获得序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行样品序列的BLAST（basic local alignment search tool）用最高相似搜索法进行确认比对分析。
2 结果与分析
2.1 植物形态鉴定
对馆藏的倒卵叶五加和短柄五加标本进行了仔细观测比对，未发现两者的显著区别。
2018年7—8月到陕甘宁地区的16个区县，对50个五加居群进行野外调查，采集标本与分析样品。采集的标本经鉴定，其中倒卵叶五加和短柄五加共42份，均鉴定为短柄五加;藤五加2份;蜀五加4份;糙叶五加2份。调查发现倒卵叶五加药材的混淆品有藤五加和蜀五加（甘肃）、糙叶五加（陕西陇县）。
倒卵叶五加药材主产地的人们对其原植物短柄五加的叫法不一，如在陕西的旬邑、黄陵、黄龙、宝塔区、志丹、陇县，甘肃的华池、合水、正宁、灵台等地称倒卵叶五加或倒刨牛;在宜君、甘泉、泾源、清水、崆峒区等地称短柄五加或甘肃刺五加，其植物特征为：直立灌木，茎圆柱形，多分枝，株高0.5～3.0 m。在灌丛的顶部常生出向上的长枝与侧生出短枝，下部老枝及根茎发出的枝条全为长枝;幼枝无毛，叶柄的基部常生1～2个刺，细长，下弯，基部不膨大。掌状复叶，小叶通常5枚;在长枝上叶互生，在短枝上叶簇生;幼枝的上部总叶柄无或极短，无毛，无刺;从枝顶15～45 cm往下，总叶柄渐长，达2～12 cm，具纵棱。从灌丛枝条上端侧生的短枝上，叶近于无柄，无毛，无刺，小叶亦较小，常数片簇生。小叶片薄纸质，倒卵形、倒卵状长圆形，稀菱形，叶尖圆形或短尖，基部狭尖，楔形，两面均无毛，边缘近全缘或上部边缘具数对钝形齿牙;侧脉3～5对。伞形花序单生或数个形成圆锥花序顶生于枝端，径1～4 cm，有花多数。总花梗长1～8 cm，具纵棱，无毛，无刺;花梗细长，长0.6～2.0 cm，无毛。由于受生长环境的影响，植株间在形态上有少许差异，如短枝上或光照不好的情况下伞形花序较小、总花梗较短，长枝上或光照较好时伞形花序较大，花梗也较长;花浅黄绿色。苞片卵形，紫色，长约1 mm，先端丛生锈毛，边缘疏生纤毛;花萼无毛或有短柔毛，边缘具5个三角形小裂齿。花瓣5枚，三角状卵形，先端尖，无毛，长约2 mm，开花时反曲。雄蕊5个，花丝长约2 mm。花柱5个，全部合生成柱状。子房5室。果实椭圆状球形，未成熟时绿色、绿黑色、黑色，成熟后黑紫色，直径5～8 mm，风干时有5棱，宿存花柱长1.5～2.0 mm。花期7—8月。
2.2 PCR扩增结果
所有五加样本ITS2序列与psbA-trnH序列PCR扩增均在序列长度500～750 bp出现一条清晰的DNA条带（图 1）。
2.3 序列测定结果
2.3.1
ITS2序列。ITS2引物的扩增效率和测序成功率均为100%。短柄五加等样本经ITS2 F/R引物扩增后得到一段长455～498 bp的序列，去掉两端的5.8S和28S区段后，获得的ITS2序列长度为229～230 bp，GC含量为62.6%～63.0%。经两头等齐对比，短柄五加在序列18位有一个C的缺失;糙叶五加与短柄五加相比在18位多一个C;藤五加与蜀五加的ITS2序列完全相同，与短柄五加相比在18位多一个C，在24位发生T/A的转换，在25位发生G/T的颠换。
短柄五加ITS2序列：
1 CGCATCGCGT CGCCCCC-AA CCCTGCACTC CCTCATGGGA GTCATGACTG
51 AGGGGCGGAT ACTGGCCTCC CGTGTCTCAC CGCGCGGTTG GCCCAAATGT
101 GAGTCCTTGG CGACGGACGT CACGACAAGT GGTGGTTGTA AAAAGCCCTC
151 TTCTCCTGTC GTGCGGTGGC CCGTCGCCAG CAAAAGCTCA TGTGACCCTG
201 TTGTGCCGTC CTCGACGAGC ACTCCGACCG
2.3.2
psbA-trnH序列。psbA-trnH引物的扩增效率与测序成功率均为100%。短柄五加等样本经psbA-F/trnH-R引物扩增得到一段长487～522 bp的序列，去掉两端的psbA和trnH基因后，获得的psbA-trnH序列长度为392～399 bp，GC含量为28.3%～28.6%。psbA-trnH序列分别在短柄五加、蜀五加和糙叶五加种内变异位点数差异为0，在藤五加种内有一个变异位点的差异。短柄五加、蜀五加及甘肃清水产的藤五加三者psbA-trnH序列完全相同，甘肃清水产藤五加以3叶为主，少5叶;陕西陇县产的藤五加全为3叶，与短柄五加相比在290位有一个G/C转换。糙叶五加与短柄五加相比分别在149、294、397位有T/G、A/G、G/A的颠换，在132～133、393位发生AA/TT、C/G的转换，在154～155位发生AT的缺失，在330～338位有一个CATAAGAAA序列片段的插入。 短柄五加psbA-trnH 序列：
1 GACCCGGTCT TAGTGTATAC GAGTTTTTTT GAAATAAAAA GGAGCAATAA
51 CCTCTTTCTT GTTCTATCAA GAGGGCGGTA TTGCTCCTTT TTTTATTTAG
101 TAGTATTTGT ACTTACCTAG TTTCTTTAAA TTTATTTAAA GAAACGTCGT
151 TTTATTTTTA TTGGTTGGTT CATGAGTGAG TATCATGCTT TCGTTCTGTA
201 TTAATCATTA ATCTAGAATT TAGCTACTTC TTCCCAATCT TTTGGGAAGT
251 ATTTTTTAAA AAGAAAAGAT AAAAATGTTG GACTTTTTAC TTAGTTAATA
301 CTTAATATTT TTATCTCGAA AATAAGAAAG AAATAATGAT GAATGGTAAA
351 AGTTTAATCT TTTGAAACGT AAGGAAAAGA ATAGTAGAGG GG
2.4 五加属植物ITS2序列的差异与遗传距离分析
五加属植物的ITS2序列长度为229～231 bp，GC含量61.1%～641%。当空位（gap）作为缺失处理时，序列两端对齐比对，属内保守位点210个，变异位点21个，简约信息位点8个，自裔位点13个（表4）。短柄五加、糙叶五加、藤五加和蜀五加的ITS2序列在种内完全相同，种内遗传距离均为0。属内种间遗传距离为0.000～0.055，平均为0.020。短柄五加和糙叶五加与红毛五加间的遗传距离为0;藤五加与蜀五加间的遗传距离为0，刺五加与无梗五加间的遗传距离为0;乌蔹莓五加与狭叶五加间的遗传距离为0。可见ITS2序列在同物种之间高度保守，同属不同种间、种内变种之间遗传距离差异有时不明显，因此，ITS2序列只能作为鉴别五加属物种的依据之一。
2.5 五加属植物psbA-trnH序列的差异与遗传距离分析
五加属植物的psbA-trnH序列长度为392～399 bp，GC含量27.4%～28.8%。当空位（gap）作为缺失处理时，序列两端对齐比对（401 bp），属内保守位点387个，变异位点14个，简约信息位点11个，自裔位点3个（表5）。糙叶五加、二歧五加、无梗五加和 E.japonicus 在154～155位有一个AT的缺失，在330～338位分别有一个CATAAGAAA的插入片段。短柄五加、蜀五加、糙叶五加3个种种内遗传距离均为0;甘肃产藤五加与陕西产藤五加的种内遗传距离为0.003。属内种间遗传距离为0.000～0.026，平均为0.013。短柄五加与蜀五加、红毛五加和甘肃产藤五加间的遗传距离为0;糙叶五加与 E.japonicus 间的遗传距离为0;二歧五加与无梗五加、刺五加之间的遗传距离为0。可见，psbA-trnH序列在同物种之间高度保守，同属不同种间遗传距离差异有时不明显，因此psbA-trnH序列也只能作为鉴别五加属物种的依据之一。
将ITS2和psbA-trnH序列的特征参数汇总（表6）。K2P遗传距离计算显示，psbA-trnH序列种间遗传距离为0.013，小于ITS2序列的种间遗传距离（0.020）;psbA-trnH序列的变异率为3.50%，小于ITS2序列的9.09%，说明psbA-trnH较ITS2序列保守，2种候选序列种内遗传距离为0或0～0003，小于种间遗传距离，存在明显的barcoding gap。
2.6 序列比对鉴定
对测定所获得的ITS2、psbA-trnH序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中利用BLAST进行最高相似性搜索，进行确认比对分析。
2.6.1 倒卵叶五加和短柄五加的鉴定。共42个样本，从植物形态上看完全相同，统一鉴定为短柄五加;所有样品其测序结果ITS2序列、psbA-trnH序列完全相同。其ITS2序列与红毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性为99.57%，而psbA-trnH序列与红毛五加（GQ435397.1）的相似性为100%，因此认为短柄五加和倒卵叶五加是同一种植物，且与红毛五加的亲缘关系较近。
2.6.2 藤五加和蜀五加的鉴定。2个种共6个样为一组，其ITS2序列完全相同，与藤五加（MH703148.1）、蜀五加（MH710849.1、MH703119.1）的相似性为100%。
在GenBank中无藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相关数据。该研究所测定的蜀五加4个样和甘肃产藤五加1个样共5个样的 psbA-trnH 与红毛五加（GQ435397.1）的相似性为100%;陕西陇县产藤五加的 psbA-trnH序列与红毛五加（GQ435397.1）的相似性為99.74%。
2.6.3 糙叶五加的鉴定。2个样本为一组，其ITS2序列与红毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性为100%，与刺五加（KU724205.1）和无梗五加（MF095901.1）的相似性为99.57%;其psbA-trnH序列与刺五加（MF348735.1）、无梗五加（KT153019.1）的相似性为99.75%，与红毛五加（GQ435397.1）的相似性仅为96.01%。
在GenBank中未见糙叶五加 ITS2和psbA-trnH序列的相关数据。 2.7 序列聚类分析
基于 K2P双参数模型构建的系统进化树能显示物种间的亲缘关系，帮助判断物种的进化关系。五加属可能起源于鹅掌柴属（ Schefflera ）[3]，故选其作为外类群构建了系统进化树。
2.7.1 ITS2序列的聚类分析。五加属植物的ITS2序列经过全局比对构建的NJ系统进化树见图2。五加属植物聚为一大支，其中所有测定的短柄五加、糙叶五加和红毛五加聚为一小支，藤五加和蜀五加聚为另一小分枝。
2.7.2 psbA-trnH序列的聚类分析。psbA-trnH序列构建的五加属植物NJ系统进化树见图3。五加属植物独聚为一支，其中所有测定的短柄五加、藤五加和蜀五加与红毛五加等聚为一小枝，糙叶五加与无梗五加、刺五加等聚为另一小枝。
3 结论
目前 DNA 条形码研究主要集中在如何提高近缘类群物种分辨率和构建区域条形码数据库2个方向。受物种特异性影响，同属物种较低的种间差异性以及分化产生的新物种的出现，都会增加物种分类鉴定的难度。
建立良好的DNA条形码鉴定体系需要几个序列进行相互补充，或与其他分子标记结合，才能提高DNA条形码技术鉴定的效率。
尽管 ITS2 序列对大多数植物可以进行鉴定，但由于其序列较短，遗传信息有限，在鉴定近缘种或变种上仍存在一些不能鉴定的情况，增加psbA-trnH序列作为物种鉴别的辅助序列，可以将短柄五加、糙叶五加、藤五加和蜀五加准确鉴定，为鉴定短柄五加及其同属植物提供新的分子鉴定方法，为控制药材质量提供科学依据。
通过对现地42个短柄五加和倒卵叶五加居群的观测，认为总叶柄的长短、伞形花序的大小、总花梗的长短是与标本采集枝条的着生部位有关，是植物适应环境条件的结果，不能作为划分种的依据。通过对42 份植物样本的ITS2和 psbA-trnH 序列测定分析，其种内序列差异为0，与五加属其他物种间序列差异明显，可以认定两者为同一个物种，命名为短柄五加，即倒卵叶五加药材的基原植物为短柄五加。
通过对糙叶五加、藤五加和蜀五加共8份植物样品的ITS2和psbA-trnH序列分析，其结果与植物形态分类相吻合，也得到较好的分类结果。
在Genbank中未见糙叶五加ITS2和psbA-trnH序列，藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相关数据。
应用 ITS2 序列和 psbA-trnH 序列的聚类分析所建的NJ系统发育树存在一定差异，在亲缘关系的分析上不够精准，还需有较多的数据积累才行。
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关键词 倒卵叶五加;短柄五加;基原鉴定;DNA条形码;ITS2;psbA-trnH
中图分类号 R 282.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）15-0166-07
Abstract [Objective]The molecular identification technique of DNA barcode was used to identify the species of several plants of Eleutherococcus Maxim. in order to understand the relationship between Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus obovatus . [Method]By observing the morphology of collection specimens and onsite plants， using universal primers ITS2 and psbAtrnH， 50 samples including Eleutherococcus brachypus collected from Shaanxi， Gansu and Ningxia were amplified and sequenced in both directions，and downloaded the sequence of Araliacea and other related plants from GenBank database， obtained ITS2 and psbAtrnH sequence through ITS2 database or its sequence annotation， and then performed BLAST comparison and identification analysis.MEGA 6.06 software was used to compare the obtained sequences， analyze the mutation sites， calculate the GC content， intra and interspecies genetic distance， and construct the NJ phylogenetic tree.[Result]The success rate of PCR amplification and sequencing of ITS2 and psbAtrnH was 100%.The plant morphology， ITS2 sequence and psbAtrnH sequence of Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus obovatus were identical. ITS2 sequence： Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus henryi had only one base difference， and the sequence of Eleutherococcus leucorrhizus var. setchuenensis was the same as that of Eleutherococcus leucorrhizus .The sequence of psbAtrnH： Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus henryi sequence were significantly different， and the sequence of Eleutherococcus brachypus and Eleutherococcus leucorrhizus var. setchuenensis was the same.[Conclusion]At the same time， using ITS2 and psbAtrnH genetic markers， DNA barcode technology can accurately identify the 4 species of Eleutherococcus Maxim.; E. brachypus and E. obovatus should be the same plant. Key words Eleutherococcus obovatus;Eleutherococcus brachypus ;Base source identification;DNA barcoding;ITS2（internal transcribed spacer 2 sequence）;psbAtrnH（psbAtrnH intergenic spacer sequence）
基金項目 陕西省科技统筹创新工程项目（2016KTTSSF 01-01-02）;陕西省咸阳市重大科技专项（2014K 01-17）。
作者简介 赵新礼（1961—），男，陕西扶风人，主任药师，从事中药资源与栽培及分子生物学研究。
收稿日期 2021-01-27
倒卵叶五加与著名的中药材刺五加具有相似的化学成分和药理作用[1-2]，倒卵叶五加与短柄五加两者分布区域重叠，植物形态高度相似，在其产区内均作为倒卵叶五加药材使用，究竟两者为同一种植物还是2种植物长期以来存在争议[3-5]。自20世纪80年代倒卵叶五加被开发以来，由于无节制的采集使资源量锐减，为保证用药的安全性和有效性，以及其野生抚育与栽培物种的准确性，有必要对该中药材的基原进行鉴定研究。
传统的中药材基原鉴定即依据其植物形态学和分类学原理，根据形态鉴别特征，确定到物种的生物学名，这种鉴定方式受到鉴定人员知识和经验等因素的影响，具有一定的局限性。DNA条形码技术是利用基因组中一段或几段公认的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，以自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的分子鉴定技术，可以对物种实现准确、快速、简便的鉴定，不受发育阶段、供试部位、环境条件等的限制，弥补了传统鉴定方法在这方面的不足。
陈士林等[6]通过对大量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究，建立以ITS2为核心、psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系，并将该方法纳入2015年版《中国药典》。ITS2序列是去除5.8S和28S rRNA基因序列的核糖体DNA序列间隔区，psbA-trnH序列是位于叶绿体编码光合系统D1蛋白的psbA基因和编码tRNA组氨酸的trnH基因之间的一段非编码区，两者均具有进化速率快、引物通用性好、片段足够短、易扩增与测序的优点，已广泛用于人参属[7]、忍冬属[8]、枸杞属[9]、益母草[10]、覆盆子[11]、商陆[12]、活血丹[13]、金叉石斛[14]等药材基原物种鉴定，五加皮[15]、竹节参[16]、当归[17]等中药材真伪鉴别，人参[18]、西洋参[18]、苍术[19]等中药材种子种苗的鉴定。
该研究采用植物形态鉴定与DNA条形码分子鉴定技术相结合，利用通用引物ITS2和psbA-trnH序列对五加属短柄五加等4种植物的50份标本进行鉴定分析，结合GenBank数据库中的近缘物种序列构建系统进化树，弄清倒卵叶五加和短柄五加间的物种关系，为倒卵叶五加药材DNA条形码鉴定方法的建立提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。
1.1.1.1 馆藏标本。西北农林科技大学和陕西中药研究所馆藏的倒卵叶五加和短柄五加标本。
1.1.1.2 现地调查。对陕西、甘肃、宁夏的16个区县进行五加资源野外调查、采集标本与分析样品（表1）。标本经西北农林科技大学吴振海高级实验师鉴定，现存放在陕西中药研究所标本室。
1.1.1.3 样品采集。每个区县选取2～4个五加居群，在每个居群内选取相距2 m以上的10个植株，每株采集嫩叶一片放入自封袋内，加入硅胶快速干燥。待叶片彻底干燥后存放于-40 ℃的冰箱中备用。
1.1.1.4 五加属等物种的ITS2和psbA-trnH序列。五加属等物种的ITS2和psbA-trnH序列均来源于GenBank数据库（表2）。
1.1.2 试剂。
DNA Marker、植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化）;Tris、EDTA、冰乙酸、琼脂糖等（西安海默生物）;DNA凝胶回收试剂盒（北京擎科新业生物）;Prime STAR HS DNA Polymerase（Takara，美国）。
1.1.3 仪器。
高速冷冻离心机（eppendorf 5810R，德国）;PCR扩增仪（Life，美国）;制冰机（IMS-50，西安仪创）;电泳仪（JUNYI-300，北京君意）;凝胶成像仪（SAGECREATION，北京赛智）;基因测序仪器（ABI 3730，美国）。
1.2 方法
1.2.1 植物标本鉴定。依照植物的形态特征，参考文献资料，按传统方法进行鉴定[4]。
1.2.2 DNA提取。用干净的剪刀将试样剪碎，混匀，称取适量，用植物基因组DNA提取试剂盒依照说明书提取，提取液 -20 ℃ 保存。
1.2.3 引物。参见《中药DNA条形码分子鉴定》[20]，由北京擎科新业生物技术有限公司合成（表3）。
1.2.4 PCR扩增及测序。
1.2.4.1 扩增体系。DNA模板1 μL，5X Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，引物1与引物2各1 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 14.75 μL补足至 25 μL。
1.2.4.2 扩增程序。94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 35 s，33 个循环;72 ℃ 5 min，16 ℃停止。
1.2.4.3 PCR产物电泳及DNA纯化回收。PCR产物经15%的琼脂糖凝胶电泳后将目的片段割胶，并使用DNA凝胶回收试剂盒按说明书进行DNA片段的纯化回收。
1.2.4.4
DNA序列的测序。將纯化的产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。
1.3 数据处理
用Chromas软件对测序所得到的峰图进行人工校对;用CodonCode Aligner V6.0.2软件进行拼接。ITS2序列基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法采用ITS2 database网站（http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/）进行序列注释，去除两端的5.8S rRNA和28S rRNA区段，获得完整的ITS2序列。根据GenBank数据库中同属物种psbA-trnH的注释，去除序列两端的psbA和trnH基因，获得完整的psbA-trnH基因间隔区序列。用MEGA 6.06软件进行序列对比，分析变异位点，计算GC含量，用Kimura 2-Parameter（K2P）法将所有数据计算种内和种间遗传距离，用NJ邻接法（Neighbour 2 Joining Method，NJ）将比对过的序列分别构建成五加属植物的ITS2、pbsA-trnH序列的系统发育树，各个分支的支持率使用bootstrap重复1 000次进行检验。最终将获得序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行样品序列的BLAST（basic local alignment search tool）用最高相似搜索法进行确认比对分析。
2 结果与分析
2.1 植物形态鉴定
对馆藏的倒卵叶五加和短柄五加标本进行了仔细观测比对，未发现两者的显著区别。
2018年7—8月到陕甘宁地区的16个区县，对50个五加居群进行野外调查，采集标本与分析样品。采集的标本经鉴定，其中倒卵叶五加和短柄五加共42份，均鉴定为短柄五加;藤五加2份;蜀五加4份;糙叶五加2份。调查发现倒卵叶五加药材的混淆品有藤五加和蜀五加（甘肃）、糙叶五加（陕西陇县）。
倒卵叶五加药材主产地的人们对其原植物短柄五加的叫法不一，如在陕西的旬邑、黄陵、黄龙、宝塔区、志丹、陇县，甘肃的华池、合水、正宁、灵台等地称倒卵叶五加或倒刨牛;在宜君、甘泉、泾源、清水、崆峒区等地称短柄五加或甘肃刺五加，其植物特征为：直立灌木，茎圆柱形，多分枝，株高0.5～3.0 m。在灌丛的顶部常生出向上的长枝与侧生出短枝，下部老枝及根茎发出的枝条全为长枝;幼枝无毛，叶柄的基部常生1～2个刺，细长，下弯，基部不膨大。掌状复叶，小叶通常5枚;在长枝上叶互生，在短枝上叶簇生;幼枝的上部总叶柄无或极短，无毛，无刺;从枝顶15～45 cm往下，总叶柄渐长，达2～12 cm，具纵棱。从灌丛枝条上端侧生的短枝上，叶近于无柄，无毛，无刺，小叶亦较小，常数片簇生。小叶片薄纸质，倒卵形、倒卵状长圆形，稀菱形，叶尖圆形或短尖，基部狭尖，楔形，两面均无毛，边缘近全缘或上部边缘具数对钝形齿牙;侧脉3～5对。伞形花序单生或数个形成圆锥花序顶生于枝端，径1～4 cm，有花多数。总花梗长1～8 cm，具纵棱，无毛，无刺;花梗细长，长0.6～2.0 cm，无毛。由于受生长环境的影响，植株间在形态上有少许差异，如短枝上或光照不好的情况下伞形花序较小、总花梗较短，长枝上或光照较好时伞形花序较大，花梗也较长;花浅黄绿色。苞片卵形，紫色，长约1 mm，先端丛生锈毛，边缘疏生纤毛;花萼无毛或有短柔毛，边缘具5个三角形小裂齿。花瓣5枚，三角状卵形，先端尖，无毛，长约2 mm，开花时反曲。雄蕊5个，花丝长约2 mm。花柱5个，全部合生成柱状。子房5室。果实椭圆状球形，未成熟时绿色、绿黑色、黑色，成熟后黑紫色，直径5～8 mm，风干时有5棱，宿存花柱长1.5～2.0 mm。花期7—8月。
2.2 PCR扩增结果
所有五加样本ITS2序列与psbA-trnH序列PCR扩增均在序列长度500～750 bp出现一条清晰的DNA条带（图 1）。
2.3 序列测定结果
2.3.1
ITS2序列。ITS2引物的扩增效率和测序成功率均为100%。短柄五加等样本经ITS2 F/R引物扩增后得到一段长455～498 bp的序列，去掉两端的5.8S和28S区段后，获得的ITS2序列长度为229～230 bp，GC含量为62.6%～63.0%。经两头等齐对比，短柄五加在序列18位有一个C的缺失;糙叶五加与短柄五加相比在18位多一个C;藤五加与蜀五加的ITS2序列完全相同，与短柄五加相比在18位多一个C，在24位发生T/A的转换，在25位发生G/T的颠换。
短柄五加ITS2序列：
1 CGCATCGCGT CGCCCCC-AA CCCTGCACTC CCTCATGGGA GTCATGACTG
51 AGGGGCGGAT ACTGGCCTCC CGTGTCTCAC CGCGCGGTTG GCCCAAATGT
101 GAGTCCTTGG CGACGGACGT CACGACAAGT GGTGGTTGTA AAAAGCCCTC
151 TTCTCCTGTC GTGCGGTGGC CCGTCGCCAG CAAAAGCTCA TGTGACCCTG
201 TTGTGCCGTC CTCGACGAGC ACTCCGACCG
2.3.2
psbA-trnH序列。psbA-trnH引物的扩增效率与测序成功率均为100%。短柄五加等样本经psbA-F/trnH-R引物扩增得到一段长487～522 bp的序列，去掉两端的psbA和trnH基因后，获得的psbA-trnH序列长度为392～399 bp，GC含量为28.3%～28.6%。psbA-trnH序列分别在短柄五加、蜀五加和糙叶五加种内变异位点数差异为0，在藤五加种内有一个变异位点的差异。短柄五加、蜀五加及甘肃清水产的藤五加三者psbA-trnH序列完全相同，甘肃清水产藤五加以3叶为主，少5叶;陕西陇县产的藤五加全为3叶，与短柄五加相比在290位有一个G/C转换。糙叶五加与短柄五加相比分别在149、294、397位有T/G、A/G、G/A的颠换，在132～133、393位发生AA/TT、C/G的转换，在154～155位发生AT的缺失，在330～338位有一个CATAAGAAA序列片段的插入。 短柄五加psbA-trnH 序列：
1 GACCCGGTCT TAGTGTATAC GAGTTTTTTT GAAATAAAAA GGAGCAATAA
51 CCTCTTTCTT GTTCTATCAA GAGGGCGGTA TTGCTCCTTT TTTTATTTAG
101 TAGTATTTGT ACTTACCTAG TTTCTTTAAA TTTATTTAAA GAAACGTCGT
151 TTTATTTTTA TTGGTTGGTT CATGAGTGAG TATCATGCTT TCGTTCTGTA
201 TTAATCATTA ATCTAGAATT TAGCTACTTC TTCCCAATCT TTTGGGAAGT
251 ATTTTTTAAA AAGAAAAGAT AAAAATGTTG GACTTTTTAC TTAGTTAATA
301 CTTAATATTT TTATCTCGAA AATAAGAAAG AAATAATGAT GAATGGTAAA
351 AGTTTAATCT TTTGAAACGT AAGGAAAAGA ATAGTAGAGG GG
2.4 五加属植物ITS2序列的差异与遗传距离分析
五加属植物的ITS2序列长度为229～231 bp，GC含量61.1%～641%。当空位（gap）作为缺失处理时，序列两端对齐比对，属内保守位点210个，变异位点21个，简约信息位点8个，自裔位点13个（表4）。短柄五加、糙叶五加、藤五加和蜀五加的ITS2序列在种内完全相同，种内遗传距离均为0。属内种间遗传距离为0.000～0.055，平均为0.020。短柄五加和糙叶五加与红毛五加间的遗传距离为0;藤五加与蜀五加间的遗传距离为0，刺五加与无梗五加间的遗传距离为0;乌蔹莓五加与狭叶五加间的遗传距离为0。可见ITS2序列在同物种之间高度保守，同属不同种间、种内变种之间遗传距离差异有时不明显，因此，ITS2序列只能作为鉴别五加属物种的依据之一。
2.5 五加属植物psbA-trnH序列的差异与遗传距离分析
五加属植物的psbA-trnH序列长度为392～399 bp，GC含量27.4%～28.8%。当空位（gap）作为缺失处理时，序列两端对齐比对（401 bp），属内保守位点387个，变异位点14个，简约信息位点11个，自裔位点3个（表5）。糙叶五加、二歧五加、无梗五加和 E.japonicus 在154～155位有一个AT的缺失，在330～338位分别有一个CATAAGAAA的插入片段。短柄五加、蜀五加、糙叶五加3个种种内遗传距离均为0;甘肃产藤五加与陕西产藤五加的种内遗传距离为0.003。属内种间遗传距离为0.000～0.026，平均为0.013。短柄五加与蜀五加、红毛五加和甘肃产藤五加间的遗传距离为0;糙叶五加与 E.japonicus 间的遗传距离为0;二歧五加与无梗五加、刺五加之间的遗传距离为0。可见，psbA-trnH序列在同物种之间高度保守，同属不同种间遗传距离差异有时不明显，因此psbA-trnH序列也只能作为鉴别五加属物种的依据之一。
将ITS2和psbA-trnH序列的特征参数汇总（表6）。K2P遗传距离计算显示，psbA-trnH序列种间遗传距离为0.013，小于ITS2序列的种间遗传距离（0.020）;psbA-trnH序列的变异率为3.50%，小于ITS2序列的9.09%，说明psbA-trnH较ITS2序列保守，2种候选序列种内遗传距离为0或0～0003，小于种间遗传距离，存在明显的barcoding gap。
2.6 序列比对鉴定
对测定所获得的ITS2、psbA-trnH序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中利用BLAST进行最高相似性搜索，进行确认比对分析。
2.6.1 倒卵叶五加和短柄五加的鉴定。共42个样本，从植物形态上看完全相同，统一鉴定为短柄五加;所有样品其测序结果ITS2序列、psbA-trnH序列完全相同。其ITS2序列与红毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性为99.57%，而psbA-trnH序列与红毛五加（GQ435397.1）的相似性为100%，因此认为短柄五加和倒卵叶五加是同一种植物，且与红毛五加的亲缘关系较近。
2.6.2 藤五加和蜀五加的鉴定。2个种共6个样为一组，其ITS2序列完全相同，与藤五加（MH703148.1）、蜀五加（MH710849.1、MH703119.1）的相似性为100%。
在GenBank中无藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相关数据。该研究所测定的蜀五加4个样和甘肃产藤五加1个样共5个样的 psbA-trnH 与红毛五加（GQ435397.1）的相似性为100%;陕西陇县产藤五加的 psbA-trnH序列与红毛五加（GQ435397.1）的相似性為99.74%。
2.6.3 糙叶五加的鉴定。2个样本为一组，其ITS2序列与红毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性为100%，与刺五加（KU724205.1）和无梗五加（MF095901.1）的相似性为99.57%;其psbA-trnH序列与刺五加（MF348735.1）、无梗五加（KT153019.1）的相似性为99.75%，与红毛五加（GQ435397.1）的相似性仅为96.01%。
在GenBank中未见糙叶五加 ITS2和psbA-trnH序列的相关数据。 2.7 序列聚类分析
基于 K2P双参数模型构建的系统进化树能显示物种间的亲缘关系，帮助判断物种的进化关系。五加属可能起源于鹅掌柴属（ Schefflera ）[3]，故选其作为外类群构建了系统进化树。
2.7.1 ITS2序列的聚类分析。五加属植物的ITS2序列经过全局比对构建的NJ系统进化树见图2。五加属植物聚为一大支，其中所有测定的短柄五加、糙叶五加和红毛五加聚为一小支，藤五加和蜀五加聚为另一小分枝。
2.7.2 psbA-trnH序列的聚类分析。psbA-trnH序列构建的五加属植物NJ系统进化树见图3。五加属植物独聚为一支，其中所有测定的短柄五加、藤五加和蜀五加与红毛五加等聚为一小枝，糙叶五加与无梗五加、刺五加等聚为另一小枝。
3 结论
目前 DNA 条形码研究主要集中在如何提高近缘类群物种分辨率和构建区域条形码数据库2个方向。受物种特异性影响，同属物种较低的种间差异性以及分化产生的新物种的出现，都会增加物种分类鉴定的难度。
建立良好的DNA条形码鉴定体系需要几个序列进行相互补充，或与其他分子标记结合，才能提高DNA条形码技术鉴定的效率。
尽管 ITS2 序列对大多数植物可以进行鉴定，但由于其序列较短，遗传信息有限，在鉴定近缘种或变种上仍存在一些不能鉴定的情况，增加psbA-trnH序列作为物种鉴别的辅助序列，可以将短柄五加、糙叶五加、藤五加和蜀五加准确鉴定，为鉴定短柄五加及其同属植物提供新的分子鉴定方法，为控制药材质量提供科学依据。
通过对现地42个短柄五加和倒卵叶五加居群的观测，认为总叶柄的长短、伞形花序的大小、总花梗的长短是与标本采集枝条的着生部位有关，是植物适应环境条件的结果，不能作为划分种的依据。通过对42 份植物样本的ITS2和 psbA-trnH 序列测定分析，其种内序列差异为0，与五加属其他物种间序列差异明显，可以认定两者为同一个物种，命名为短柄五加，即倒卵叶五加药材的基原植物为短柄五加。
通过对糙叶五加、藤五加和蜀五加共8份植物样品的ITS2和psbA-trnH序列分析，其结果与植物形态分类相吻合，也得到较好的分类结果。
在Genbank中未见糙叶五加ITS2和psbA-trnH序列，藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相关数据。
应用 ITS2 序列和 psbA-trnH 序列的聚类分析所建的NJ系统发育树存在一定差异，在亲缘关系的分析上不够精准，还需有较多的数据积累才行。
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