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摘 要:目的:建立小承气汤中番泻苷A的HPLC含量测定方法｡方法:采用Sinochrom C18柱(250mm×4.6mm),流动相:乙腈:水:冰醋酸(60:35:5),流速:1.0ml/min,检测波长:340nm｡结果:番泻苷A在0.2～1.0μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=124.72X+6.5(r=0.9995)｡结论:所建立的HPLC方法可用于小承气汤的质量控制｡
关键词:HPLC 小承气汤 番泻苷A
小承气汤出自《伤寒论》,适用于阳明腑实证，可以治疗粘连性肠梗阻､肠麻痹､慢性胃炎等[1]｡小承气汤现代处方：大黄12g､厚朴6g､枳实9g,水煎服[2]｡有关小承气汤的质量研究文献报道很少，胡晓静等测定了小承气汤中的大黄酸和厚朴酚的含量[3],而大黄中番泻苷A的含量测定则未见报道｡本文通过HPLC测定小承气汤中番泻苷A的含量,为小承气汤今后的深入研究提供参考｡
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 BF-KNAUER 高效液相色谱仪,K-501高压输液泵,K-2501紫外分光检测器,BF-2002色谱工作站;FA2104 万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂)｡TY-CZ1006超声波清洗仪(常州天亿电子设备有限公司)
1.1.2 药材与试剂 药材购于长沙市老百姓大药房,经本校生药教研室鉴定,大黄为Rheum officinale Baill的根茎;枳实为Citrus anrantium L.的干燥幼果;厚朴为Magnolia officinalis Rehd.et Wils番泻苷A(日本纯药工业株式会提供)｡乙腈为色谱纯,其余所用试剂均为分析纯｡
1.2 实验方法
1.2.1 小承气汤的制备 按处方比例分别称取大黄12g､厚朴6g､枳实9g,按参考文献方法精密加入10倍量水浸泡1h后,电炉直火加热回流1h[4],冷却至室温,抽滤即得小承气汤样品液｡
1.2.2 阴性对照液的制备 按处方比例称取厚朴6g､枳实9g,按2.1进行制备,得阴性小承气汤样品液｡
1.2.3 大黄煎煮液的制备 称取大黄12g,按2.1进行制备,得大黄单煎液｡
2 结果
番泻苷A的测定｡
2.1 色谱条件 依立特Sinochrom C18柱(250mm×4.6mm);流动相:乙腈:水:冰醋酸(60:35:5);流速:1.0ml/min;柱温:30℃;检测波长:340nm;进样量:20μl｡
2.2 标准曲线的绘制 精密称取番泻苷A 5mg,以pH 8.0的磷酸缓冲液溶解,并定容至50ml,得番泻苷A贮备液｡精密吸取该溶液5ml，用70%甲醇定容至10ml,在所设定的HPLC条件下,以上述溶液分别进样4μl､6μl､8μl､10μl､20μl,以峰面积（Y）为纵坐标,进样量(X，μg)为横坐标,得到标准曲线为Y=12472X+265(r=0.9995)｡
2.3精密度试验 取上述番泻苷A溶液,在上述色谱条件下测定,重复进样5次,结果番泻苷A RSD为1.97%， 结果表明,进样精密度良好｡
2.4 稳定性实验 取小承气汤样品溶液按“样品液中番泻苷A含量测定”项下方法处理,分别于0,2,4,8,12,24h对样品进行分析,RSD为3.2%｡
2.5 重复性实验 取小承气汤样品溶液3份(每份25ml)， 按“样品液中番泻苷A含量测定”项下方法处理,测定并计算番泻苷A含量,RSD为2.2%｡
2.6 大黄药材中番泻苷A的含量测定[5] 精密称取大黄粉末5g入具塞试管中,精密加入pH 8.O的磷酸盐缓冲液20ml,40℃超声波提取30min，3000r/min离心10min，精密量取5ml，加70%甲醇定容至10ml,按上述条件,进样量为10μl,测得原药材中番泻苷A的含量为0.28mg/g｡
2.7 样品液中番泻苷A含量测定:分别精密量取各样品溶液25ml，60℃水浴上蒸干，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液20ml，40℃超声波提取30min，3000r/min离心10min，精密量取5ml，加70%甲醇定容至10ml，按上述条件,进样量为20μl,番泻苷A含量(μg/ml)结果:大黄单煎液18.76,小承气汤样品液19.04,阴性对照液(-)｡色谱图见图1,图2｡
2.8 加样回收率实验精密量取小承气汤样品溶液3份（每份25ml），分别精密加入番泻苷A 对照液0.2､0.4､0.6ml溶液,其余操作同2.4.7,番泻苷A得平均加样回收率为97.4%，RSD为1.9%｡
3 讨论
小承气汤具有明显泻下作用,其物质基础在于方中的大黄及其煎出的结合蒽醌｡测定小承气汤中番泻苷A的含量,为探讨小承气汤的有效成分及其质量评价,提供了参考依据｡番泻苷A在紫外200～400nm中,在340,270nm处有较强吸收,选用270nm为检测波长,实验中发现干扰较大,所以选择340nm作为检测波长｡番泻苷A结构中含有-COOH,故HPLC洗脱剂应加入酸,避免脱尾巴现象,本实验中发现用冰醋酸的效果优于磷酸｡
参考文献
1､吴照平,王全德. 加味小承气汤临床应用[J]. 陕西中医，1984,5 （4） ：25
2､彭怀仁. 中华名医方剂大全[M]. 北京：金盾出版社，1990：58
3､胡晓静，高轶哲，李飞,等. HPLC 法测定小承气汤中大黄酸和厚朴酚的含量[J].沈阳药科大学学报,2007,24(1):26-28
4､李文瑞.金匮要略汤证论治(第1版)[M].北京:中国科学出版社,1993:312
5､裴 刚,何桂霞,杜方麓,等.大承气汤分煎与混煎化学等值初步研究[J].中成药,2000,22（9）：603-605
(收稿日期:2007.12.2)
关键词:HPLC 小承气汤 番泻苷A
小承气汤出自《伤寒论》,适用于阳明腑实证，可以治疗粘连性肠梗阻､肠麻痹､慢性胃炎等[1]｡小承气汤现代处方：大黄12g､厚朴6g､枳实9g,水煎服[2]｡有关小承气汤的质量研究文献报道很少，胡晓静等测定了小承气汤中的大黄酸和厚朴酚的含量[3],而大黄中番泻苷A的含量测定则未见报道｡本文通过HPLC测定小承气汤中番泻苷A的含量,为小承气汤今后的深入研究提供参考｡
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 BF-KNAUER 高效液相色谱仪,K-501高压输液泵,K-2501紫外分光检测器,BF-2002色谱工作站;FA2104 万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂)｡TY-CZ1006超声波清洗仪(常州天亿电子设备有限公司)
1.1.2 药材与试剂 药材购于长沙市老百姓大药房,经本校生药教研室鉴定,大黄为Rheum officinale Baill的根茎;枳实为Citrus anrantium L.的干燥幼果;厚朴为Magnolia officinalis Rehd.et Wils番泻苷A(日本纯药工业株式会提供)｡乙腈为色谱纯,其余所用试剂均为分析纯｡
1.2 实验方法
1.2.1 小承气汤的制备 按处方比例分别称取大黄12g､厚朴6g､枳实9g,按参考文献方法精密加入10倍量水浸泡1h后,电炉直火加热回流1h[4],冷却至室温,抽滤即得小承气汤样品液｡
1.2.2 阴性对照液的制备 按处方比例称取厚朴6g､枳实9g,按2.1进行制备,得阴性小承气汤样品液｡
1.2.3 大黄煎煮液的制备 称取大黄12g,按2.1进行制备,得大黄单煎液｡
2 结果
番泻苷A的测定｡
2.1 色谱条件 依立特Sinochrom C18柱(250mm×4.6mm);流动相:乙腈:水:冰醋酸(60:35:5);流速:1.0ml/min;柱温:30℃;检测波长:340nm;进样量:20μl｡
2.2 标准曲线的绘制 精密称取番泻苷A 5mg,以pH 8.0的磷酸缓冲液溶解,并定容至50ml,得番泻苷A贮备液｡精密吸取该溶液5ml，用70%甲醇定容至10ml,在所设定的HPLC条件下,以上述溶液分别进样4μl､6μl､8μl､10μl､20μl,以峰面积（Y）为纵坐标,进样量(X，μg)为横坐标,得到标准曲线为Y=12472X+265(r=0.9995)｡
2.3精密度试验 取上述番泻苷A溶液,在上述色谱条件下测定,重复进样5次,结果番泻苷A RSD为1.97%， 结果表明,进样精密度良好｡
2.4 稳定性实验 取小承气汤样品溶液按“样品液中番泻苷A含量测定”项下方法处理,分别于0,2,4,8,12,24h对样品进行分析,RSD为3.2%｡
2.5 重复性实验 取小承气汤样品溶液3份(每份25ml)， 按“样品液中番泻苷A含量测定”项下方法处理,测定并计算番泻苷A含量,RSD为2.2%｡
2.6 大黄药材中番泻苷A的含量测定[5] 精密称取大黄粉末5g入具塞试管中,精密加入pH 8.O的磷酸盐缓冲液20ml,40℃超声波提取30min，3000r/min离心10min，精密量取5ml，加70%甲醇定容至10ml,按上述条件,进样量为10μl,测得原药材中番泻苷A的含量为0.28mg/g｡
2.7 样品液中番泻苷A含量测定:分别精密量取各样品溶液25ml，60℃水浴上蒸干，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液20ml，40℃超声波提取30min，3000r/min离心10min，精密量取5ml，加70%甲醇定容至10ml，按上述条件,进样量为20μl,番泻苷A含量(μg/ml)结果:大黄单煎液18.76,小承气汤样品液19.04,阴性对照液(-)｡色谱图见图1,图2｡
2.8 加样回收率实验精密量取小承气汤样品溶液3份（每份25ml），分别精密加入番泻苷A 对照液0.2､0.4､0.6ml溶液,其余操作同2.4.7,番泻苷A得平均加样回收率为97.4%，RSD为1.9%｡
3 讨论
小承气汤具有明显泻下作用,其物质基础在于方中的大黄及其煎出的结合蒽醌｡测定小承气汤中番泻苷A的含量,为探讨小承气汤的有效成分及其质量评价,提供了参考依据｡番泻苷A在紫外200～400nm中,在340,270nm处有较强吸收,选用270nm为检测波长,实验中发现干扰较大,所以选择340nm作为检测波长｡番泻苷A结构中含有-COOH,故HPLC洗脱剂应加入酸,避免脱尾巴现象,本实验中发现用冰醋酸的效果优于磷酸｡
参考文献
1､吴照平,王全德. 加味小承气汤临床应用[J]. 陕西中医，1984,5 （4） ：25
2､彭怀仁. 中华名医方剂大全[M]. 北京：金盾出版社，1990：58
3､胡晓静，高轶哲，李飞,等. HPLC 法测定小承气汤中大黄酸和厚朴酚的含量[J].沈阳药科大学学报,2007,24(1):26-28
4､李文瑞.金匮要略汤证论治(第1版)[M].北京:中国科学出版社,1993:312
5､裴 刚,何桂霞,杜方麓,等.大承气汤分煎与混煎化学等值初步研究[J].中成药,2000,22（9）：603-605
(收稿日期:2007.12.2)