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摘要 目的：基于網络药理学预测苦参-地榆治疗溃疡性结肠炎（UC）的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中药数据库检索苦参-地榆药对的化学成分和靶基因，以口服生物利用度（OB）>30%和类药性（DL）>0.18为条件筛选药对的潜在有效成分，并通过TCMSP预测药对的潜在靶点。运用Uniprot数据库寻找到潜在靶点相对应的人类基因名称，通过Genecards、OMIM数据库检索溃疡性结肠炎的疾病靶点，与药对的潜在靶点相映射，绘制韦恩图，将映射找到的有效成分的靶基因导入Cytoscape3.7.2构建药物-成分-疾病-靶点网络图。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图选出核心靶标，最后将苦参-地榆药对治疗溃疡性结肠炎的有效靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：共获得苦参-地榆药对27个有效成分和74个有效靶点。GO富集分析结果显示90个生物过程，主要与DNA结合和蛋白质或辅助因子结合等相关;KEGG通路富集结果显示115条通路，主要包括PI3K-AKT信号通路、癌症通路等。结论：苦参-地榆药对多种活性成分作用于多靶点、多途径、多通路协同发挥治疗UC。
关键词 网络药理学;苦参;地榆;溃疡性结肠炎;作用机制;成分;靶点;通路
Evaluation of the Active Ingredients and Potential Targets of Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae in the Treatment of Ulcerative Colitis with a Network Pharmacology Approach
WANG Di1，LIU Lulu1，SHI Xuewen2
（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）
Abstract Objective：To predict the mechanism of treatment of ulcerative colitis（UC）with Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae Based on network pharmacology.Methods：Chemical composition and target genes of the Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair were searched through the TCMSP database of traditional Chinese medicines（TCM），and the potential active ingredients of the drug pair were screened under the condition of bioavailability（OB）>30% and drug-like properties（DL）>0.18.The TCMSP database was used to predict potential targets for the drug pair.Uniprot database was used to find the name of the human gene corresponding to the potential target.The disease target of UC were retrieved through Genecards and OMIM database，and was then mapped to the potential target of the drug pair into a Wayne diagram.The target gene of the component is introduced into Cytoscape 3.7.2 to construct the drug-component-disease-target network diagram.The STRING database was used to construct a PPI protein interaction network diagram to select the core target.Finally，the Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair was used for GO analysis and KEGG analysis of effective targets for the treatment of ulcerative colitis.Results：A total of 27 active ingredients and 74 effective targets were obtained from the Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair.GO enrichment analysis results showed a total of 90 biological processes，mainly related to DNA binding and protein or cofactor binding; KEGG pathway enrichment results showed totally 115 pathways，including PI3K-AKT signaling pathway and cancer pathway.Conclusion：Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair can act on multiple targets，multiple channels，and multiple pathways to treat UC in a variety of active ingredients.This study provides a theoretical reference for further research on the mechanism of action of Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair on UC clinical treatment. Keywords Network pharmacology; Radix Sophorae Flavescentis; Radix Sanguisorbae; Ulcerative colitis; Mechanism of action; Component; Target; Pathway
中图分类号：R282;R573文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.007
溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是以腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重为主要症状的慢性非特异性肠道炎性疾病[1]。特征为肠黏膜炎症复发与缓解交替，从直肠开始并延伸至近端结肠[2]。对于轻度至中度UC的治疗，通常使用口服或直肠给予5-氨基水杨酸制剂;治疗中至重度结肠炎的药物类别包括硫嘌呤、靶向肿瘤坏死因子制剂和整联蛋白类生物制剂以及小分子Janus激酶抑制剂。但面临不良反应多、服药周期长、经济负担重等问题[3-4]。中医中药治疗UC在缓解临床症状、抗炎、促进肠道黏膜修复、调节机体免疫力、防止复发等方面有明显的优势[5]。UC在中医学属“肠澼”“泄泻”“久痢”等范畴[6]。基本病机为湿热蕴肠、气滞络瘀，脾虚失健为主要发病基础，饮食不调是主要发病诱因。中医学将UC分为6个主要证型，其中以大肠湿热证最为常见[7]。
苦参-地榆药对是导师史学文教授治疗UC大肠湿热证的常用药对，为治疗UC经验方圣瑜方中的君药，在改善患者临床症状、改善肠道菌群，促进肠黏膜修复方面取得良好的疗效。方中苦参味苦、性寒，归心、肝、胃、大肠、膀胱经，可清热燥湿、杀虫、利尿，用于治疗热痢、便血。《名医别录》记载：“养肝胆气，定志益精，利九窍，除伏热肠澼……令人嗜食。”地榆味苦酸，性寒，归肝、肺、肾和大肠经，具有凉血止血、清热解毒、收敛止泻之功效。两药合用，共奏清热祛湿之功。有研究显示，复方苦参汤在治疗UC方面取得良好疗效，方中多见苦参与地榆的配伍[8-9]。然而苦参-地榆药对复杂的化学成分使其难以明确其治疗UC的具体作用机制。现采用网络药理学方法，通过挖掘苦参-地榆药对的活性成分，预测其作用机制。
1 资料与方法
1.1 药物潜在有效成分的獲取 分别使用苦参、地榆为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMSP http：//lsp.nwu.edu.cn/）搜索，获得苦参和地榆所有的化学信息，通过参考文献中的多个标准，将口服生物利用度（OB）>30%和类药性（DL）>0.18为条件[10]，筛选出苦参和地榆的有效活性成分。
1.2 药物潜在靶基因的获取 通过TCMSP检索苦参和地榆的所有活性成分的靶点，并与已得到的有效活性成分相映射，获得潜在靶点，利用Perl（http：//www.Perl.org/）和UniProt数据库（http：//www.UniProt.org/）将靶蛋白名转化为基因名。
1.3 UC疾病靶点的获取 为了揭示可能与疾病有关的基因，使用“Ulcerative colitis作为关键词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）及OMIM数据库（https：//omim.org/）搜索，获得UC的所有相关基因及靶点蛋白。所有的数据库都不断更新着人类基因和基因疾病的信息，提供一个相对全面的研究结果。从搜索结果中删除重复的靶基因，并导出到Excel，为后续处理做准备。
1.4 药物疾病靶点韦恩图的绘制 利用R x64 4.0.0软件并输入命令代码，在R中安装绘制韦恩图的工具包。将已获得的药物活性成分和疾病靶点导入，在R中输入了特定的命令代码，从而生成韦恩图和体现具体分析结果的文本，文本将用于后续处理。通过韦恩图可以更加直观地看出，苦参-地榆药对是通过多基因、多靶点来治疗溃疡性结肠炎。
1.5 药物-成分-疾病-靶点网络构建 将药物疾病的共同靶点与药物的有效活性成分相映射，得到苦参-地榆有效成分治疗UC的靶点。将得到的靶点数据及苦参、地榆成分名称和UC名称导入Cytoscape3.7.2软件，获得药物-成分-疾病-靶点（M-I-D-T）网络图。
1.6 核心靶标蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 将药对和疾病的共同靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），并限定物种为人类物种（Homo sapiens），该数据库是一个蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）数据库，可以搜索已知蛋白质并预测PPI[11]。检索研究相关文献，为确保可信度，将交互分数限定为>0.90，去除无相互作用的单一蛋白，获得最终的PPI网络图，导出图片并以TSV格式保存结果，利用R x64 4.0.0软件，将结果挑选出前30名核心靶标，并绘制柱状图。
1.7 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析 Biocounductor（http：//www.bioconductor.org/）为高通量基因组数据的分析和解释提供工具，它使用编程软件R，是一个开源和开放式开发软件[12]。在R包的帮助下，成功地安装了这个分析工具，然后运行代码。对药物和疾病的共同靶点基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析（以P≤0.05为筛选标准）。通过计算得分，选出了前20名进行展示。
2 结果
2.1 潜在有效成分筛选结果 通过TCMSP收集到苦参113个化学成分，地榆41个化学成分，共154个化学成分。设定上述过滤条件后共获得有效成分58个，其中苦参45个，如苦参碱、槐果碱、福莫尼汀、顺二氢槲皮素、醋胺、木犀草素等，地榆13个，如β-西他固醇、山柰酚、槲皮素、三七皂苷等。见表1。 2.2 药物疾病靶基因结果与韦恩图的绘制 在获得的苦参-地榆58個有效成分中，通过Uniprot数据库共找到人类相关靶点759个，通过GeneCards数据库及OMIM数据库共找到UC潜在靶点4 357个，利用R x64 3.6.2软件取二者交集，得到药物与疾病的共同靶点74个，并绘制韦恩图。见图1。
2.3 药物-成分-疾病-靶点网络构建 通过映射共获得苦参-地榆治疗UC的有效成分27个，将有效成分和共同靶点导入Cytoscape3.7.2软件，获得苦参-地榆治疗UC的“药物-成分-疾病-靶点”网络。见图2。图中共有103个节点，344条边，节点包括药物、疾病、成分、靶点，边则表示其之间存在相互关系，红色菱形代表疾病，紫色六边形代表药物，蓝色长方形代表活性成分，黄色椭圆形代表靶点基因。通过此网络直观的看出苦参-地榆药对治疗UC是通过多种成分、多种靶点来发挥作用。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、福莫尼汀的自由度值分别是118、24、22、11，说明这些成分与疾病相关度较高。
2.4 PPI网络图与核心靶标柱状图 利用STRING数据库获得蛋白互作网络。见图3。图中共有74个节点，143条边，节点代表蛋白，平均节点度3.86，节点代表靶标蛋白，边表示蛋白质与蛋白质之间的关系。浅蓝色边代表来自管理的数据库，紫色边代表实验测定，绿色边代表基因相邻，红色边代表基因融合，深蓝色边代表基因共现，黄色边代表文本挖掘，黑色边代表共表达，淡蓝色边代表蛋白质同源性。利用R软件挑选出前30位核心靶标并绘制柱状图。如ESR1、RELA、CCND1、EGFR、Fos、MAPK8、NR3C1、CASP3、IL6、RB1、AR等，提示这些靶标可能在苦参-地榆治疗UC中发挥重要作用。见图4。
2.5 GO分析与KEGG通路分析 为了更全面、更具体地阐明苦参-地榆活性成分对UC的影响，利用ClusterProfiler对成分-疾病-靶网络中74个常见靶点进行了GO富集分析。共得到90个生物过程，确定前20个富集GO项，以条形图显示（设定P≤0.05分）。见图5。如泛素样蛋白连接酶结合（GO：0044389）、DNA结合转录激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性（GO：0001228）、泛素蛋白连接酶结合（GO：0031625）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合（GO：0001085）、核受体活动（GO：0004879）、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA结合（GO：0098531）、类固醇激素受体（GO：0003707）等生物过程。同时，气泡图显示一个生物过程中所涉及的目标基因数与所有注释基因数的基因比率。比值越高，富集程度越高。点的大小反映了分析中目标基因的数量，点的不同颜色表示不同的P调整值范围（设定P≤0.05）。见图6。
为了阐明74个潜在靶点治疗UC的关键途径，进行KEGG通路富集分析（设定P≤0.05），共得到115条通路，选取前20条绘制柱状图和气泡图。见图7、图8。如PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路（hsa05167）、癌症中的蛋白多糖通路（hsa05205）、人巨细胞病毒感染通路（hsa05163）、癌症中的microRNAs通路（hsa05206）、乙型肝炎通路（Bhsa05161）、前列腺癌通路（hsa05215）、细胞凋亡通路（hsa04210）等，结果显示苦参-地榆药对治疗UC与多种通路密切相关。
3 讨论
UC的发病具有多基因联合的复杂遗传背景，基因多态性和异质性与其易感性联系密切。再加上环境、心理等多因素共同作用，导致黏膜屏障功能受损，上皮细胞通透性改变，肠道菌群紊乱，神经内分泌调节异常，代谢产物破坏肠黏膜，引起或加重肠黏膜炎症反应，导致UC的发生[13]。苦参及复方制剂的多成分、多靶点、多功能、多通路在治疗UC方面显示出无可比拟的优势[14]。
本研究基于现代药理研究与网络药理学平台探讨苦参-地榆药对治疗UC的作用机制，共收集到27种有效成分。槲皮素与山柰酚均属于黄酮类化合物，研究证实，山柰酚具有很好的抗炎活性，口服山柰酚可以有效抑制某些与UC相关的标志物[15]。槲皮素能抑制体内过氧化物的生成，有效清除体内的自由基，提高抗氧化能力，改善肠道菌群多样性[16]。李钦等[17]发现槲皮素可以抑制醋酸诱导的UC小鼠腹腔毛细血管通透性增加，证明其在非特异性炎症反应的急性时期即可发挥抗炎功效，并通过抗氧自由基获得镇痛作用。木犀草素可以抑制炎性浸润、渗出和组织增生，减轻肠黏膜的病理损害[18]。李越[19]证实木犀草素可激活Nrf2信号通路，抑制炎症介质TNF-α，IL-6mRNA表达，增强结肠抗氧化活性。杨倩等[20]研究发现，刺芒柄花素（Formononetin）可通过激活Nrf2的表达，抑制炎症介质TNF-α，IL-6，改善结肠组织氧化压力参数，降低UC的发生。苦参碱对UC和肺部损伤具有很好的保护作用，可能与调节TFF3表达有关[21]。苦参碱能明显抵抗UC的炎症反应，增强机体免疫，通过调节肠黏膜细胞因子平衡，抑制黏膜细胞氧自由基的产生和抗氧化功能干预UC的发病并降低肿瘤的发生率[22-23]。
药物-成分-疾病-靶点网络图的构建，可直观感受到苦参-地榆药对治疗UC是通过多成分、多靶点发挥作用。在PPI网络图中可以看到靶点间有多种相互作用，连接度越大，表明药物通过该靶点治疗UC的可能性越大。PPI网络中按度值排名可发现ESR1、RELA、CCND1、EGFR、FOS、MAPK8等是治疗UC的关键靶点。ESR1，核激素受体，类固醇激素及其受体参与真核基因表达的调节，并影响靶组织中的细胞增殖和分化。现代研究证明，在UC患者中，炎症活动性黏膜ESR1甲基化程度升高，且参与了UC的致癌作用[24]。RELA（核因子κB，P65）是信号通路核因子κB中的一员。核因子κB是一种几乎所有细胞类型中都存在的多效转录因子，涉及细胞的转化、增殖和凋亡，参与调节多种炎症反应和免疫基因的转录和表达[25]。在UC患者中可以观察到核因子κB的表达增加，特别是在黏膜巨噬细胞和上皮细胞中，同时还伴有炎症介质TNF-α，IL-6的增加[26]。CCND1在调节细胞增殖中起重要作用，研究表明，结肠癌患者CCND1表达显著升高，进而影响结肠癌细胞SW620的迁移和增殖[27]。表皮生长因子受体（EGFR）是酪氨酸激酶家族中的一员，通过其配体表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）的激活，调节细胞的增殖、黏附、运动、蛋白水解酶的分泌等[28]。研究表明，EGFR在非活动期UC患者结肠黏膜中的表达较活动期UC患者和对照组明显增加。EGFR在UC患者结肠炎症黏膜修复过程中可能起一定作用，过度不恰当的表达可能在细胞的恶性转化中起作用，促进溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的发生[29-30]。MAPK8是MAPK信号转导途经中重要的信号分子，其功能涉及细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等各种机制。研究表明UC大鼠MAPK8的表达增加，与其参与细胞凋亡过程有关[31]。 GO功能分析发现苦参-地榆治疗UC重要的生物过程包括DNA结合和蛋白质或辅助因子结合。通过这些生物过程，药物作用于相关靶位，从而影响相关信号通路以发挥药效。通过KEGG通路分析，苦参-地榆主要通过某些癌症、疾病、肿瘤坏死因子信号通路和压力信号通路发挥作用。最近的研究表明，免疫反应紊乱与炎症介质和抗炎细胞因子之间的表达失衡有关。细胞因子的表达和分泌与PI3K-AKT信號通路密切相关。研究表明，免疫细胞如中性粒细胞激活PI3K-AKT信号通路，致PI3K、磷酸化AKT和AKT高表达，磷酸化AKT（p-AKT）可以通过增强IjB（主要是IjBa）的磷酸化和减少IjB的合成来激活NF-jB。NF-jB的激活促进了TNF-α、IL-1β等炎症介质的表达和分泌，导致细胞因子分泌失衡，引起一系列炎症反应和黏膜损伤的发生，从而导致UC的发生[32]。苦参-地榆药对治疗UC可能是有效成分作用于PI3K-AKT信号通路，进一步干预通路中核因子κB转录，进而影响下游RELA（核因子κB，P65）的表达。
本研究初步探讨了苦参-地榆药对通过多成分、多靶点、多通路治疗UC的机制，与现有的研究结果基本一致，但仍有部分功能和信号通路需要进一步实验证实。本研究借助网络药理学进行预测性探讨，为苦参-地榆药对治疗UC提供理论支持。
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（2020-05-24收稿 責任编辑：杨觉雄）
关键词 网络药理学;苦参;地榆;溃疡性结肠炎;作用机制;成分;靶点;通路
Evaluation of the Active Ingredients and Potential Targets of Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae in the Treatment of Ulcerative Colitis with a Network Pharmacology Approach
WANG Di1，LIU Lulu1，SHI Xuewen2
（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）
Abstract Objective：To predict the mechanism of treatment of ulcerative colitis（UC）with Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae Based on network pharmacology.Methods：Chemical composition and target genes of the Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair were searched through the TCMSP database of traditional Chinese medicines（TCM），and the potential active ingredients of the drug pair were screened under the condition of bioavailability（OB）>30% and drug-like properties（DL）>0.18.The TCMSP database was used to predict potential targets for the drug pair.Uniprot database was used to find the name of the human gene corresponding to the potential target.The disease target of UC were retrieved through Genecards and OMIM database，and was then mapped to the potential target of the drug pair into a Wayne diagram.The target gene of the component is introduced into Cytoscape 3.7.2 to construct the drug-component-disease-target network diagram.The STRING database was used to construct a PPI protein interaction network diagram to select the core target.Finally，the Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair was used for GO analysis and KEGG analysis of effective targets for the treatment of ulcerative colitis.Results：A total of 27 active ingredients and 74 effective targets were obtained from the Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair.GO enrichment analysis results showed a total of 90 biological processes，mainly related to DNA binding and protein or cofactor binding; KEGG pathway enrichment results showed totally 115 pathways，including PI3K-AKT signaling pathway and cancer pathway.Conclusion：Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair can act on multiple targets，multiple channels，and multiple pathways to treat UC in a variety of active ingredients.This study provides a theoretical reference for further research on the mechanism of action of Radix Sophorae Flavescentis-Radix Sanguisorbae drug pair on UC clinical treatment. Keywords Network pharmacology; Radix Sophorae Flavescentis; Radix Sanguisorbae; Ulcerative colitis; Mechanism of action; Component; Target; Pathway
中图分类号：R282;R573文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.007
溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是以腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重为主要症状的慢性非特异性肠道炎性疾病[1]。特征为肠黏膜炎症复发与缓解交替，从直肠开始并延伸至近端结肠[2]。对于轻度至中度UC的治疗，通常使用口服或直肠给予5-氨基水杨酸制剂;治疗中至重度结肠炎的药物类别包括硫嘌呤、靶向肿瘤坏死因子制剂和整联蛋白类生物制剂以及小分子Janus激酶抑制剂。但面临不良反应多、服药周期长、经济负担重等问题[3-4]。中医中药治疗UC在缓解临床症状、抗炎、促进肠道黏膜修复、调节机体免疫力、防止复发等方面有明显的优势[5]。UC在中医学属“肠澼”“泄泻”“久痢”等范畴[6]。基本病机为湿热蕴肠、气滞络瘀，脾虚失健为主要发病基础，饮食不调是主要发病诱因。中医学将UC分为6个主要证型，其中以大肠湿热证最为常见[7]。
苦参-地榆药对是导师史学文教授治疗UC大肠湿热证的常用药对，为治疗UC经验方圣瑜方中的君药，在改善患者临床症状、改善肠道菌群，促进肠黏膜修复方面取得良好的疗效。方中苦参味苦、性寒，归心、肝、胃、大肠、膀胱经，可清热燥湿、杀虫、利尿，用于治疗热痢、便血。《名医别录》记载：“养肝胆气，定志益精，利九窍，除伏热肠澼……令人嗜食。”地榆味苦酸，性寒，归肝、肺、肾和大肠经，具有凉血止血、清热解毒、收敛止泻之功效。两药合用，共奏清热祛湿之功。有研究显示，复方苦参汤在治疗UC方面取得良好疗效，方中多见苦参与地榆的配伍[8-9]。然而苦参-地榆药对复杂的化学成分使其难以明确其治疗UC的具体作用机制。现采用网络药理学方法，通过挖掘苦参-地榆药对的活性成分，预测其作用机制。
1 资料与方法
1.1 药物潜在有效成分的獲取 分别使用苦参、地榆为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMSP http：//lsp.nwu.edu.cn/）搜索，获得苦参和地榆所有的化学信息，通过参考文献中的多个标准，将口服生物利用度（OB）>30%和类药性（DL）>0.18为条件[10]，筛选出苦参和地榆的有效活性成分。
1.2 药物潜在靶基因的获取 通过TCMSP检索苦参和地榆的所有活性成分的靶点，并与已得到的有效活性成分相映射，获得潜在靶点，利用Perl（http：//www.Perl.org/）和UniProt数据库（http：//www.UniProt.org/）将靶蛋白名转化为基因名。
1.3 UC疾病靶点的获取 为了揭示可能与疾病有关的基因，使用“Ulcerative colitis作为关键词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）及OMIM数据库（https：//omim.org/）搜索，获得UC的所有相关基因及靶点蛋白。所有的数据库都不断更新着人类基因和基因疾病的信息，提供一个相对全面的研究结果。从搜索结果中删除重复的靶基因，并导出到Excel，为后续处理做准备。
1.4 药物疾病靶点韦恩图的绘制 利用R x64 4.0.0软件并输入命令代码，在R中安装绘制韦恩图的工具包。将已获得的药物活性成分和疾病靶点导入，在R中输入了特定的命令代码，从而生成韦恩图和体现具体分析结果的文本，文本将用于后续处理。通过韦恩图可以更加直观地看出，苦参-地榆药对是通过多基因、多靶点来治疗溃疡性结肠炎。
1.5 药物-成分-疾病-靶点网络构建 将药物疾病的共同靶点与药物的有效活性成分相映射，得到苦参-地榆有效成分治疗UC的靶点。将得到的靶点数据及苦参、地榆成分名称和UC名称导入Cytoscape3.7.2软件，获得药物-成分-疾病-靶点（M-I-D-T）网络图。
1.6 核心靶标蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 将药对和疾病的共同靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），并限定物种为人类物种（Homo sapiens），该数据库是一个蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）数据库，可以搜索已知蛋白质并预测PPI[11]。检索研究相关文献，为确保可信度，将交互分数限定为>0.90，去除无相互作用的单一蛋白，获得最终的PPI网络图，导出图片并以TSV格式保存结果，利用R x64 4.0.0软件，将结果挑选出前30名核心靶标，并绘制柱状图。
1.7 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析 Biocounductor（http：//www.bioconductor.org/）为高通量基因组数据的分析和解释提供工具，它使用编程软件R，是一个开源和开放式开发软件[12]。在R包的帮助下，成功地安装了这个分析工具，然后运行代码。对药物和疾病的共同靶点基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析（以P≤0.05为筛选标准）。通过计算得分，选出了前20名进行展示。
2 结果
2.1 潜在有效成分筛选结果 通过TCMSP收集到苦参113个化学成分，地榆41个化学成分，共154个化学成分。设定上述过滤条件后共获得有效成分58个，其中苦参45个，如苦参碱、槐果碱、福莫尼汀、顺二氢槲皮素、醋胺、木犀草素等，地榆13个，如β-西他固醇、山柰酚、槲皮素、三七皂苷等。见表1。 2.2 药物疾病靶基因结果与韦恩图的绘制 在获得的苦参-地榆58個有效成分中，通过Uniprot数据库共找到人类相关靶点759个，通过GeneCards数据库及OMIM数据库共找到UC潜在靶点4 357个，利用R x64 3.6.2软件取二者交集，得到药物与疾病的共同靶点74个，并绘制韦恩图。见图1。
2.3 药物-成分-疾病-靶点网络构建 通过映射共获得苦参-地榆治疗UC的有效成分27个，将有效成分和共同靶点导入Cytoscape3.7.2软件，获得苦参-地榆治疗UC的“药物-成分-疾病-靶点”网络。见图2。图中共有103个节点，344条边，节点包括药物、疾病、成分、靶点，边则表示其之间存在相互关系，红色菱形代表疾病，紫色六边形代表药物，蓝色长方形代表活性成分，黄色椭圆形代表靶点基因。通过此网络直观的看出苦参-地榆药对治疗UC是通过多种成分、多种靶点来发挥作用。其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、福莫尼汀的自由度值分别是118、24、22、11，说明这些成分与疾病相关度较高。
2.4 PPI网络图与核心靶标柱状图 利用STRING数据库获得蛋白互作网络。见图3。图中共有74个节点，143条边，节点代表蛋白，平均节点度3.86，节点代表靶标蛋白，边表示蛋白质与蛋白质之间的关系。浅蓝色边代表来自管理的数据库，紫色边代表实验测定，绿色边代表基因相邻，红色边代表基因融合，深蓝色边代表基因共现，黄色边代表文本挖掘，黑色边代表共表达，淡蓝色边代表蛋白质同源性。利用R软件挑选出前30位核心靶标并绘制柱状图。如ESR1、RELA、CCND1、EGFR、Fos、MAPK8、NR3C1、CASP3、IL6、RB1、AR等，提示这些靶标可能在苦参-地榆治疗UC中发挥重要作用。见图4。
2.5 GO分析与KEGG通路分析 为了更全面、更具体地阐明苦参-地榆活性成分对UC的影响，利用ClusterProfiler对成分-疾病-靶网络中74个常见靶点进行了GO富集分析。共得到90个生物过程，确定前20个富集GO项，以条形图显示（设定P≤0.05分）。见图5。如泛素样蛋白连接酶结合（GO：0044389）、DNA结合转录激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性（GO：0001228）、泛素蛋白连接酶结合（GO：0031625）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合（GO：0001085）、核受体活动（GO：0004879）、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA结合（GO：0098531）、类固醇激素受体（GO：0003707）等生物过程。同时，气泡图显示一个生物过程中所涉及的目标基因数与所有注释基因数的基因比率。比值越高，富集程度越高。点的大小反映了分析中目标基因的数量，点的不同颜色表示不同的P调整值范围（设定P≤0.05）。见图6。
为了阐明74个潜在靶点治疗UC的关键途径，进行KEGG通路富集分析（设定P≤0.05），共得到115条通路，选取前20条绘制柱状图和气泡图。见图7、图8。如PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路（hsa05167）、癌症中的蛋白多糖通路（hsa05205）、人巨细胞病毒感染通路（hsa05163）、癌症中的microRNAs通路（hsa05206）、乙型肝炎通路（Bhsa05161）、前列腺癌通路（hsa05215）、细胞凋亡通路（hsa04210）等，结果显示苦参-地榆药对治疗UC与多种通路密切相关。
3 讨论
UC的发病具有多基因联合的复杂遗传背景，基因多态性和异质性与其易感性联系密切。再加上环境、心理等多因素共同作用，导致黏膜屏障功能受损，上皮细胞通透性改变，肠道菌群紊乱，神经内分泌调节异常，代谢产物破坏肠黏膜，引起或加重肠黏膜炎症反应，导致UC的发生[13]。苦参及复方制剂的多成分、多靶点、多功能、多通路在治疗UC方面显示出无可比拟的优势[14]。
本研究基于现代药理研究与网络药理学平台探讨苦参-地榆药对治疗UC的作用机制，共收集到27种有效成分。槲皮素与山柰酚均属于黄酮类化合物，研究证实，山柰酚具有很好的抗炎活性，口服山柰酚可以有效抑制某些与UC相关的标志物[15]。槲皮素能抑制体内过氧化物的生成，有效清除体内的自由基，提高抗氧化能力，改善肠道菌群多样性[16]。李钦等[17]发现槲皮素可以抑制醋酸诱导的UC小鼠腹腔毛细血管通透性增加，证明其在非特异性炎症反应的急性时期即可发挥抗炎功效，并通过抗氧自由基获得镇痛作用。木犀草素可以抑制炎性浸润、渗出和组织增生，减轻肠黏膜的病理损害[18]。李越[19]证实木犀草素可激活Nrf2信号通路，抑制炎症介质TNF-α，IL-6mRNA表达，增强结肠抗氧化活性。杨倩等[20]研究发现，刺芒柄花素（Formononetin）可通过激活Nrf2的表达，抑制炎症介质TNF-α，IL-6，改善结肠组织氧化压力参数，降低UC的发生。苦参碱对UC和肺部损伤具有很好的保护作用，可能与调节TFF3表达有关[21]。苦参碱能明显抵抗UC的炎症反应，增强机体免疫，通过调节肠黏膜细胞因子平衡，抑制黏膜细胞氧自由基的产生和抗氧化功能干预UC的发病并降低肿瘤的发生率[22-23]。
药物-成分-疾病-靶点网络图的构建，可直观感受到苦参-地榆药对治疗UC是通过多成分、多靶点发挥作用。在PPI网络图中可以看到靶点间有多种相互作用，连接度越大，表明药物通过该靶点治疗UC的可能性越大。PPI网络中按度值排名可发现ESR1、RELA、CCND1、EGFR、FOS、MAPK8等是治疗UC的关键靶点。ESR1，核激素受体，类固醇激素及其受体参与真核基因表达的调节，并影响靶组织中的细胞增殖和分化。现代研究证明，在UC患者中，炎症活动性黏膜ESR1甲基化程度升高，且参与了UC的致癌作用[24]。RELA（核因子κB，P65）是信号通路核因子κB中的一员。核因子κB是一种几乎所有细胞类型中都存在的多效转录因子，涉及细胞的转化、增殖和凋亡，参与调节多种炎症反应和免疫基因的转录和表达[25]。在UC患者中可以观察到核因子κB的表达增加，特别是在黏膜巨噬细胞和上皮细胞中，同时还伴有炎症介质TNF-α，IL-6的增加[26]。CCND1在调节细胞增殖中起重要作用，研究表明，结肠癌患者CCND1表达显著升高，进而影响结肠癌细胞SW620的迁移和增殖[27]。表皮生长因子受体（EGFR）是酪氨酸激酶家族中的一员，通过其配体表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）的激活，调节细胞的增殖、黏附、运动、蛋白水解酶的分泌等[28]。研究表明，EGFR在非活动期UC患者结肠黏膜中的表达较活动期UC患者和对照组明显增加。EGFR在UC患者结肠炎症黏膜修复过程中可能起一定作用，过度不恰当的表达可能在细胞的恶性转化中起作用，促进溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的发生[29-30]。MAPK8是MAPK信号转导途经中重要的信号分子，其功能涉及细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等各种机制。研究表明UC大鼠MAPK8的表达增加，与其参与细胞凋亡过程有关[31]。 GO功能分析发现苦参-地榆治疗UC重要的生物过程包括DNA结合和蛋白质或辅助因子结合。通过这些生物过程，药物作用于相关靶位，从而影响相关信号通路以发挥药效。通过KEGG通路分析，苦参-地榆主要通过某些癌症、疾病、肿瘤坏死因子信号通路和压力信号通路发挥作用。最近的研究表明，免疫反应紊乱与炎症介质和抗炎细胞因子之间的表达失衡有关。细胞因子的表达和分泌与PI3K-AKT信號通路密切相关。研究表明，免疫细胞如中性粒细胞激活PI3K-AKT信号通路，致PI3K、磷酸化AKT和AKT高表达，磷酸化AKT（p-AKT）可以通过增强IjB（主要是IjBa）的磷酸化和减少IjB的合成来激活NF-jB。NF-jB的激活促进了TNF-α、IL-1β等炎症介质的表达和分泌，导致细胞因子分泌失衡，引起一系列炎症反应和黏膜损伤的发生，从而导致UC的发生[32]。苦参-地榆药对治疗UC可能是有效成分作用于PI3K-AKT信号通路，进一步干预通路中核因子κB转录，进而影响下游RELA（核因子κB，P65）的表达。
本研究初步探讨了苦参-地榆药对通过多成分、多靶点、多通路治疗UC的机制，与现有的研究结果基本一致，但仍有部分功能和信号通路需要进一步实验证实。本研究借助网络药理学进行预测性探讨，为苦参-地榆药对治疗UC提供理论支持。
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（2020-05-24收稿 責任编辑：杨觉雄）