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摘要 [目的]研究20种荷花材料遗传多样性和亲缘关系。[方法]利用ISSR-PCR体系筛选出16条多态性引物，并利用16条ISSR引物对20种荷花材料进行PCR扩增。[结果]16条引物扩增出225个位点，多态性位点占75.56%。通过Popgene32软件计算出20个荷花品种间的相似性系数为0.577 8～0.951 1，平均值为0.779 6。通过聚类分析将20个荷花品种分为两大类，白洋淀红莲和冬瓜莲可归为一类，其他18个品种划分为第二类。[结论]ISSR标记技术可有效应用于不同荷花品种的遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定。
关键词 荷花；ISSR；聚类分析；遗传多样性
中图分类号 S188+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0128-05
Genetic Diversity of 20 Nelumbo nucifera Gaertn.Varieties Revealed by ISSR Analysis
HE Tian-you1，SHEN Shao-yan1，QU Yin-quan2，ZHENG Yu-shan1，2* et al （1.College of Landscape，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002；2.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002）
Abstract [Objective]To study the genetic diversity of 20 species of plant samples in Nelumbo nucifera Gaertn..[Method]16 primers were screened by using ISSR amplification system，and the DNA was used to amplify of 20 species of plant samples with 16 primers.[Result]16 primers produced 225 loci， the percentage of polymorphic loci was up to 75.56%.The genetic similarity coefficient of 20 species in squash ranged from 0.577 8 to 0.951 1，which was calculated by Popgene32.20 varieties by UPMGA analysis could be clustered into two groups，the first group included Baiyangdianhonglian and Donggualian； the rest of varieties was included in second group.[Conclusion]ISSR molecular markers could be effectively used in genetic diversity and fingerprint analysis for 20 species of plant samples in Nelumbo nucifera Gaertn..
Key words Nelumbo nucifera Gaertn.；ISSR；Cluster analysis；Genetic diversity
荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科莲属多年生大型水生草本[1]，近年来对荷花药理[2-4]、园林应用[5]、分子遗传标记[6-8]等方面已有不少研究。荷花是起源较早的被子植物之一，现有中国莲种系、中国莲亚种莲种系和中美杂种莲种系3个种系[9]，种质资源十分丰富且栽培历史悠久[10]。最原始的荷花品种是野生红莲，之后逐渐演化出众多花型、花色、株型各不相同的荷花品种，目前，我国培育出的具有观赏价值的优良品种荷花已达300种[10]。张行言等[9]按照观赏植物的“二元分类法”原则，编制了新的荷花品种分类系统，将种源作为1级品种分类标准，按株型、花型、花色的顺序，共分为3系、6群、16类、48型，现今暂包括608个品种，新的分类系统符合荷花品种的演化趋势，便于实际观赏应用。随着现代植物分子生物学的快速发展，分子标记技术被广泛应用于遗传多样性以及指纹图谱构建的研究，目前应用较为广泛的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP[11-15]等。尽管DNA分子标记技术种类多，但是各有优缺点，如 RFLP 需要放射性同位素，AFLP 需要特定的酶切与连接，RAPD 和 AP-PCR 的稳定性及重复性不好等[16]。现阶段用
于荷花遗传多样性和亲本鉴定研究的技术主要有RAPD和ISSR分子标记技术[9-10，17]。
ISSR（Inter Simper Sequence Repeat，简单重复序列标记）是由加拿大的Zietkiewicz等提出来的，是以SSR来设计引物，对引物3′或5′端锚定，通过引物对基因组进行扩增的标记系统。ISSR具有稳定、高效、重复性高、DNA用量少等特点[16，18-20]。ISSR相较于RAPD稳定性更好，能够检测出更多种质资源间的遗传多态性及差异性[21-22]。因此，ISSR标记技术被广泛用于生物的遗传多态性研究[23-25]、优良品种鉴定[26]、构建遗传图及系统分类学研究等诸多领域，且对于构建背景种质狭窄的指纹图谱具有很大潜力[27]。针对20个不同地域的荷花品种，进行ISSR分子标记和遗传多样性分析，为荷花品种及种质资源的鉴定提供试验基础和技术支持。 1 材料与方法
1.1 材料
供试的20种荷花材料来源于福建省建宁县莲子科学研究所，荷花品种及来源见表1。每个品种采样3片以上，放在自封袋中，加入硅胶干燥，尽快转移至-80 ℃冰箱，以备DNA提取。
1.2 方法
1.2.1 总DNA的提取与检测。
采用天根公司植物基因组总DNA提取试剂盒（北京，DP305-02）提取荷花基因组总DNA，在此基础上，增加了GP1、GP2缓冲液及三氯甲烷的用量。用微量紫外分光光度计检测提取的DNA浓度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Sensi Ansys凝胶分析软件检测提取的DNA质量及完整性[28-30]，后将总DNA样品置于-20 ℃保存备用。
1.2.2 引物筛选。
用已经优化好的ISSR-PCR体系，对哥伦比亚大学（University of British Columbia Biotechnology，UBC）提供的100条通用引物序列进行筛选，最终筛选出重复性、多态性和稳定性都较好引物16条，引物序列如表2所示。
1.2.3 ISSR 反应体系及程序。
参照黄宇等[31]优化的荷花ISSR反应体系并稍作修改，具体扩增反应体系如下：20 μL PCR反应体系中，包含2 μL的10×PCR Buffer，0.4 mmol/L dNTPs，3.5 mmol/L Mg2+，1.5 U Taq DNA聚合酶，0.4 μmol/L 引物，3 ng模板DNA；PCR的扩增程序为94 ℃ 2 min预变性；94 ℃ 30 s变性，54.5 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，45个循环；72 ℃ 7 min延伸，4 ℃下保存。
1.2.4 数据处理。
经过电泳分离后，凝胶同一位置上出现的条带具有同源性，且属于同一位点，对所得的扩增结果进行记录，以1代表有条带，0代表没有条带，建立一个二元0-1矩阵，输入到Excel表格中。借助Popgene32软件[32]得出20个荷花品种遗传多样性参数，进行遗传多样性分析，再使用SPSS 13.0统计软件对数据进行处理，根据遗传距离采用UPGMA进行聚类分析，绘制成ISSR树状聚类图。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果 用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测试剂盒提取的各品种荷花DNA，结果显示DNA条带清晰明亮，没有发生明显的拖尾现象，点样孔附近也较为干净，表明杂质基本去除干净（图1），符合ISSR扩增的试验要求，经紫外分光光度计检测各荷花品种DNA浓度均为20～50 ng/μL。
2.2 引物筛选扩增结果
利用最终筛选出的18条引物对20个荷花品种DNA进行多态性扩增，结果如表2所示，共扩增出225个ISSR位点，多态性位点有170个，多态性位点百分率为75.56%，扩增片段大小为300～3 000 bp，每个引物扩增的位点数为9～23个，平均每个引物扩增出14.1个位点，UBC836扩增的位点最多为23个，扩增出最少的位点为9个，多态性位点是UBC857（图2、3）。用来衡量种群间遗传变异情况的重要指标就是多态性百分比。多态性百分比越高，一个种群适应能力强，反之则弱。试验表明20个荷花品种的多态性都较高，遗传基础范围广，适应性强，遗传多样性比较丰富。
2.3 荷花品种的遗传多样性水平分析
遗传距离越小则遗传相似系数越大，亲缘关系越近，荷花品种间的差异程度越小。利用Popgene32软件分析，获得了20个荷花品种间的遗传相似系数和遗传距离，各荷花品种间的遗传相似系数为0.577 8～0.951 1，平均值为0.779 6。说明20个荷花品种间有一定的遗传差异，这种差异不大，它们之间存在着一定的亲缘关系。十里荷和白洋淀红莲之间的亲缘关系最远，遗传相似系数为0.577 8，遗传距离为0.548 6；红花建莲和白花建莲之间的遗传相似系数为0.951 1，遗传距离为0.050 1。利用Popgene32软件进行计算分析，结果表明20个荷花品种的观测等位基因数为1.155 6个，平均有效等位基因数为1.336 3，平均Nei’s基因多样性指数为0.209 4，平均Shannon多样性指数为0.328 4，说明20个荷花品种间存在着丰富的遗传多样性。
2.4 荷花品种的ISSR聚类分析
利用SPSS 18.0软件对20个荷花品种进行遗传距离和遗传相似度的聚类分析。利用UPGMA法对20个荷花品种进行聚类分析得到树状聚类图。从图4可以看出，在遗传距离阈值0.378 5处将20个品种分为两类，第一类为白洋淀红莲和冬瓜莲，剩余品种为第二类。由于白洋淀红莲和冬瓜莲同采于一个种源地，所以两者的遗传距离较近。在遗传距离阈值0.488 8处可把20个荷花品种分為4个小组，第1组为白洋淀红莲和冬瓜莲，第2组为太空3号和太空4号，第3组有建选21号，第4组为剩余品种。可看出荷花品种间的亲缘关系与地域分布没有显著关系，可能与荷花的后期培育有关。
3 讨论与结论
ISSR标记具有多态性内容丰富、信息量大、受外界环境影响较小、研究结果较稳定等优点[33]。然而关于ISSR分子标记技术在荷花遗传多样性分析上的研究报道不多。该试验采用ISSR分子标记技术对20个荷花品种进行遗传多样性分析，通过16条引物共在20个荷花品种中扩增出225个位点，其中多态性位点170个，多态性位点百分率为75.56%。此外，进一步分析了6个地域种群的遗传多样性，结果表明湖南湘潭种群的遗传多样性最大，浙江杭州及浙江金华种群最小，说明湖南湘潭种群内的遗传分化程度最大，浙江杭州及金华种群的遗传分化程度最低。种群间的遗传分化系数能划分群体间及群体内遗传变异的相对大小，是阐述群体遗传变异的主要来源[33]。 该试验利用ISSR分子标记技术揭示了荷花20个品种间的遗传多样性。20个荷花品种间的Nei’s基因多样性指数为0.209 4，遗传相似系数介于0.577 8～0.951 1。聚类分析将20个荷花品种分为两大类四小组，该研究可为荷花种质资源的收集和品种间亲缘关系鉴定提供一定科学依据。
参考文献
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关键词 荷花；ISSR；聚类分析；遗传多样性
中图分类号 S188+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0128-05
Genetic Diversity of 20 Nelumbo nucifera Gaertn.Varieties Revealed by ISSR Analysis
HE Tian-you1，SHEN Shao-yan1，QU Yin-quan2，ZHENG Yu-shan1，2* et al （1.College of Landscape，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002；2.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002）
Abstract [Objective]To study the genetic diversity of 20 species of plant samples in Nelumbo nucifera Gaertn..[Method]16 primers were screened by using ISSR amplification system，and the DNA was used to amplify of 20 species of plant samples with 16 primers.[Result]16 primers produced 225 loci， the percentage of polymorphic loci was up to 75.56%.The genetic similarity coefficient of 20 species in squash ranged from 0.577 8 to 0.951 1，which was calculated by Popgene32.20 varieties by UPMGA analysis could be clustered into two groups，the first group included Baiyangdianhonglian and Donggualian； the rest of varieties was included in second group.[Conclusion]ISSR molecular markers could be effectively used in genetic diversity and fingerprint analysis for 20 species of plant samples in Nelumbo nucifera Gaertn..
Key words Nelumbo nucifera Gaertn.；ISSR；Cluster analysis；Genetic diversity
荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科莲属多年生大型水生草本[1]，近年来对荷花药理[2-4]、园林应用[5]、分子遗传标记[6-8]等方面已有不少研究。荷花是起源较早的被子植物之一，现有中国莲种系、中国莲亚种莲种系和中美杂种莲种系3个种系[9]，种质资源十分丰富且栽培历史悠久[10]。最原始的荷花品种是野生红莲，之后逐渐演化出众多花型、花色、株型各不相同的荷花品种，目前，我国培育出的具有观赏价值的优良品种荷花已达300种[10]。张行言等[9]按照观赏植物的“二元分类法”原则，编制了新的荷花品种分类系统，将种源作为1级品种分类标准，按株型、花型、花色的顺序，共分为3系、6群、16类、48型，现今暂包括608个品种，新的分类系统符合荷花品种的演化趋势，便于实际观赏应用。随着现代植物分子生物学的快速发展，分子标记技术被广泛应用于遗传多样性以及指纹图谱构建的研究，目前应用较为广泛的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP[11-15]等。尽管DNA分子标记技术种类多，但是各有优缺点，如 RFLP 需要放射性同位素，AFLP 需要特定的酶切与连接，RAPD 和 AP-PCR 的稳定性及重复性不好等[16]。现阶段用
于荷花遗传多样性和亲本鉴定研究的技术主要有RAPD和ISSR分子标记技术[9-10，17]。
ISSR（Inter Simper Sequence Repeat，简单重复序列标记）是由加拿大的Zietkiewicz等提出来的，是以SSR来设计引物，对引物3′或5′端锚定，通过引物对基因组进行扩增的标记系统。ISSR具有稳定、高效、重复性高、DNA用量少等特点[16，18-20]。ISSR相较于RAPD稳定性更好，能够检测出更多种质资源间的遗传多态性及差异性[21-22]。因此，ISSR标记技术被广泛用于生物的遗传多态性研究[23-25]、优良品种鉴定[26]、构建遗传图及系统分类学研究等诸多领域，且对于构建背景种质狭窄的指纹图谱具有很大潜力[27]。针对20个不同地域的荷花品种，进行ISSR分子标记和遗传多样性分析，为荷花品种及种质资源的鉴定提供试验基础和技术支持。 1 材料与方法
1.1 材料
供试的20种荷花材料来源于福建省建宁县莲子科学研究所，荷花品种及来源见表1。每个品种采样3片以上，放在自封袋中，加入硅胶干燥，尽快转移至-80 ℃冰箱，以备DNA提取。
1.2 方法
1.2.1 总DNA的提取与检测。
采用天根公司植物基因组总DNA提取试剂盒（北京，DP305-02）提取荷花基因组总DNA，在此基础上，增加了GP1、GP2缓冲液及三氯甲烷的用量。用微量紫外分光光度计检测提取的DNA浓度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Sensi Ansys凝胶分析软件检测提取的DNA质量及完整性[28-30]，后将总DNA样品置于-20 ℃保存备用。
1.2.2 引物筛选。
用已经优化好的ISSR-PCR体系，对哥伦比亚大学（University of British Columbia Biotechnology，UBC）提供的100条通用引物序列进行筛选，最终筛选出重复性、多态性和稳定性都较好引物16条，引物序列如表2所示。
1.2.3 ISSR 反应体系及程序。
参照黄宇等[31]优化的荷花ISSR反应体系并稍作修改，具体扩增反应体系如下：20 μL PCR反应体系中，包含2 μL的10×PCR Buffer，0.4 mmol/L dNTPs，3.5 mmol/L Mg2+，1.5 U Taq DNA聚合酶，0.4 μmol/L 引物，3 ng模板DNA；PCR的扩增程序为94 ℃ 2 min预变性；94 ℃ 30 s变性，54.5 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，45个循环；72 ℃ 7 min延伸，4 ℃下保存。
1.2.4 数据处理。
经过电泳分离后，凝胶同一位置上出现的条带具有同源性，且属于同一位点，对所得的扩增结果进行记录，以1代表有条带，0代表没有条带，建立一个二元0-1矩阵，输入到Excel表格中。借助Popgene32软件[32]得出20个荷花品种遗传多样性参数，进行遗传多样性分析，再使用SPSS 13.0统计软件对数据进行处理，根据遗传距离采用UPGMA进行聚类分析，绘制成ISSR树状聚类图。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果 用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测试剂盒提取的各品种荷花DNA，结果显示DNA条带清晰明亮，没有发生明显的拖尾现象，点样孔附近也较为干净，表明杂质基本去除干净（图1），符合ISSR扩增的试验要求，经紫外分光光度计检测各荷花品种DNA浓度均为20～50 ng/μL。
2.2 引物筛选扩增结果
利用最终筛选出的18条引物对20个荷花品种DNA进行多态性扩增，结果如表2所示，共扩增出225个ISSR位点，多态性位点有170个，多态性位点百分率为75.56%，扩增片段大小为300～3 000 bp，每个引物扩增的位点数为9～23个，平均每个引物扩增出14.1个位点，UBC836扩增的位点最多为23个，扩增出最少的位点为9个，多态性位点是UBC857（图2、3）。用来衡量种群间遗传变异情况的重要指标就是多态性百分比。多态性百分比越高，一个种群适应能力强，反之则弱。试验表明20个荷花品种的多态性都较高，遗传基础范围广，适应性强，遗传多样性比较丰富。
2.3 荷花品种的遗传多样性水平分析
遗传距离越小则遗传相似系数越大，亲缘关系越近，荷花品种间的差异程度越小。利用Popgene32软件分析，获得了20个荷花品种间的遗传相似系数和遗传距离，各荷花品种间的遗传相似系数为0.577 8～0.951 1，平均值为0.779 6。说明20个荷花品种间有一定的遗传差异，这种差异不大，它们之间存在着一定的亲缘关系。十里荷和白洋淀红莲之间的亲缘关系最远，遗传相似系数为0.577 8，遗传距离为0.548 6；红花建莲和白花建莲之间的遗传相似系数为0.951 1，遗传距离为0.050 1。利用Popgene32软件进行计算分析，结果表明20个荷花品种的观测等位基因数为1.155 6个，平均有效等位基因数为1.336 3，平均Nei’s基因多样性指数为0.209 4，平均Shannon多样性指数为0.328 4，说明20个荷花品种间存在着丰富的遗传多样性。
2.4 荷花品种的ISSR聚类分析
利用SPSS 18.0软件对20个荷花品种进行遗传距离和遗传相似度的聚类分析。利用UPGMA法对20个荷花品种进行聚类分析得到树状聚类图。从图4可以看出，在遗传距离阈值0.378 5处将20个品种分为两类，第一类为白洋淀红莲和冬瓜莲，剩余品种为第二类。由于白洋淀红莲和冬瓜莲同采于一个种源地，所以两者的遗传距离较近。在遗传距离阈值0.488 8处可把20个荷花品种分為4个小组，第1组为白洋淀红莲和冬瓜莲，第2组为太空3号和太空4号，第3组有建选21号，第4组为剩余品种。可看出荷花品种间的亲缘关系与地域分布没有显著关系，可能与荷花的后期培育有关。
3 讨论与结论
ISSR标记具有多态性内容丰富、信息量大、受外界环境影响较小、研究结果较稳定等优点[33]。然而关于ISSR分子标记技术在荷花遗传多样性分析上的研究报道不多。该试验采用ISSR分子标记技术对20个荷花品种进行遗传多样性分析，通过16条引物共在20个荷花品种中扩增出225个位点，其中多态性位点170个，多态性位点百分率为75.56%。此外，进一步分析了6个地域种群的遗传多样性，结果表明湖南湘潭种群的遗传多样性最大，浙江杭州及浙江金华种群最小，说明湖南湘潭种群内的遗传分化程度最大，浙江杭州及金华种群的遗传分化程度最低。种群间的遗传分化系数能划分群体间及群体内遗传变异的相对大小，是阐述群体遗传变异的主要来源[33]。 该试验利用ISSR分子标记技术揭示了荷花20个品种间的遗传多样性。20个荷花品种间的Nei’s基因多样性指数为0.209 4，遗传相似系数介于0.577 8～0.951 1。聚类分析将20个荷花品种分为两大类四小组，该研究可为荷花种质资源的收集和品种间亲缘关系鉴定提供一定科学依据。
参考文献
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