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【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2016）2
摘要：目的 探究mir-137在正常肝细胞与肝癌细胞之间的表达差异及其对肝癌细胞HEP3B生物学行为的影响。方法 采用实时荧光定量PCR检测正常细胞与肝癌细胞中mir-137的表达差异。利用CCK-8方法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布差异，transwell检测细胞体外侵袭能力，划痕修复方法检测细胞迁移能力。结果 mir-137在正常肝细胞与肝癌细胞中具有显著差异，可抑制细胞增殖、侵袭及迁移能力；促进细胞的凋亡，使细胞周期阻滞在G1期。
关键词：mir-137；肝癌细胞；增殖；周期；凋亡；侵袭；迁移
Mir137定位于1P22的AK094607基因中，在结肠癌、卵巢癌、胃癌等癌症中扮演着抑癌基因的角色[1-3]。本文就mir137在肝癌细胞中的表达差异，及其对肝癌细胞增殖和周期凋亡的调节作用进行研究。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 正常肝细胞HL-7702， 肝癌细胞HUH7、HEPG2、HCC-LM3、MHCC-97H、MHCC-97L、HEP3B、SMCC-7721（购自中科院上海或昆明细胞库）。
1.1.2 主要试剂 胎牛血清（BI）；胰酶（GIBCO）；DMEM（corning）；PBS（amerosco）Lipofectamin 2000转染试剂（Invitrogen）；Trizol（invitrogen）；实时荧光定量通用试剂（Cat# GMRS-001吉玛）；CCK-8试剂盒（东仁化学）；PI（sigma）；FITC-PI凋亡试剂盒（美季生物）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养、转染及实验分组 HL-7702、HUH7、HEPG2、HCC-LM3、MHCC-97H、MHCC-97L、HEP3B、SMCC-7721常规以10%FBS胎牛血清的DMEM培养液，置于37?C 5% CO2培养箱中培养。 HEP3B细胞根据lipo2000的说明书进行转染，最终mir-137 mimics终浓度为20nM。转染后继续培养24-48h，进行后续实验。
1.2.2 RNA抽提、逆转录及荧光定量PCR 使用Trizol方法提取细胞的总RNA，CDNA的逆转录按照试剂盒进行。 Mir-137上游引物序列为5，- CCATTCATTCGTTATTGCTTAAGA-3，，下游为5，- TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC -3，。按PCR试剂盒说明书配置PCR体系。采用MX3000P实时荧光定量PCR仪（Stratagene， U.S.），两步法扩展目的片段，以U6为内参，上游序列为5，- ATTGGAACGATACAGAGAAGATT -3，，下游序列为5，- GGAACGCTTCACGAATTTG -3，。 mir137表达量为对照，基因的相对表达量=2-??Ct（?Ct=目的基因Ct-内参基因Ct）。
1.2.3 细胞增殖实验 HEP3B细胞接种96孔板，用于细胞转染。分别于转染前、转染后24、48、72小时，倾去培养液，加入新鲜的培养基100μl，每孔避光加入CCK8 10μl，避光培养2.5小时，酶标仪（thermo）450nm波长测OD值。
1.2.4细胞周期、凋亡实验 细胞转染后24h，以不含EDTA胰酶消化，周期组75%乙醇4℃固定过夜。预冷PBS重悬细胞后。加入150 ulRNaseA重悬细胞，37℃消化30分钟。加入100 ul PI工作液，4℃避光染色30分钟。凋亡组按试剂盒说明书，分别以Annexin V-FITC、PI孵育适当时间后，在1 小时内用流式细胞仪检测（BD）。
1.2.5 迁移、侵袭实验 细胞转染后24h，迁移组在孔板中培养至95%融合，用20ul枪头在孔板中均匀画直线横穿过孔，每孔三条。用PBS洗除划下的细胞，加入2%FBS培养基。放入37?C 5% CO2培养箱继续培养， 0h、6h、12h拍照，做数据统计；侵袭组，更换为5%血清的培养基饥饿培养24h。实验前一天铺好matrigel胶（BD），置于培养箱使胶凝固。以胰酶消化后，上室加入5%血清含量的200ul细胞悬液，下室加入15%血清含量的700ul培养基。48h后，取出小室，用棉签擦去上层未过膜的细胞，PBS洗三遍。4%多聚甲醛室温固定30min。PBS洗三遍，风干后加入结晶紫，染色30min。显微镜下拍照，做数据统计。
1.3 数据统计
所有数据采用Graphpad prism 5.0进行统计分析，数值变量采用x±s进行，均数采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 肝癌细胞与正常细胞中mir-137表达差异：荧光定量PCR检测结果显示，肝癌细胞中的mir-137表达量显著低于正常肝细胞。见图1
2.2 mir-137 mimics抑制细胞增殖：CCK-8细胞增殖实验显示，上调mir-137的表达后，实验组的增殖速率明显低于对照组，mir-137 mimics对细胞增殖具有抑制作用。见图1
2.3上调mir-137促进细胞凋亡，使细胞阻滞在G1期：Mir-137 mimics转染细胞与对照组比较，细胞的凋亡率明显增高。细胞周期分布也发生了改变，mir-137 mimics组细胞阻滞于G1期，而S期细胞比例有所下降。见图1
2.4 mir-137的表达影响肝癌细胞的迁移及侵袭能力：与对照组相比，mir-137 mimics组划痕愈合速度减慢。Transwell侵袭实验中，对照组的过膜细胞数，明显多于mir-137 mimics组。见图1 3 讨论
MicroRNA 是一类由内源基因编码的长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与了人体几乎所有的细胞进程的调控。研究显示mir137在多种肿瘤细胞中表达异常，与肿瘤的增殖、侵袭、周期等功能密切相关。通过靶向不同的基因，mir-137在多种肿瘤细胞中，调控细胞的增殖、侵袭、迁移等重要功能[4-10]。
肝癌作为常见的恶性肿瘤之一[11]，随着时代的发展，其发病因素也由早期的环境因素发展为复杂的多方面因素综合影响。积极预防及早期的诊治、治疗仍为提高肝癌预后及生存率的主要方法。目前，肝癌中晚期的治疗方式有：血管介入治疗，分子靶向及化疗药物治疗，放射治疗和局部消融治疗[12]。其中分子靶向治疗作为一种全新的治疗方法，正在逐渐兴起，已商业化的靶向治疗药物有索拉菲尼等。靶向治疗是以肿瘤细胞的某个特异性受体、基因或是特有的分子为靶点进行特异性阻断，从而达到抑制肿瘤生长的目的。
本文实验结果显示，通过上调mir-137在肝癌细胞中的表达，可明显抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，使细胞分裂阻滞在G1期，并降低肝癌细胞的迁移及侵袭能力。由此可以推断，mir-137在肝癌细胞中扮演着抑癌基因的角色。类似的情况也出现在卵巢癌、胃癌、结肠癌等肿瘤细胞中[4-10]，Mir-137可通过靶向不同的基因实现其抑癌基因的功能。Mir-137在肝癌细胞中通过靶向哪个基因实现其功能，该基因是否有可能成为新的肝癌细胞分子治疗靶点，值得后期深入的研究。
参考文献
[1] 张炎，虞积耀，郭世伟，王育红. 靶向肝素酶基因的microRNA在胃癌中的表达[J]. 第二军医大学学报. 2012，33（2）：200-203.
[2] Li Liang， Xianzheng Li， Xiaojing Zhang， Zhenbing Lv， Guoyang He.et al. MicroRNA-137， an HMGA1 Target， Suppresses Colorectal Cancer CellInvasion and Metastasis in Mice by Directly Targeting FMNL2[J]. GASTROENTEROLOGY， 2013， 144：624–635.
[3] JinlingGuo， Bairong Xia， FanlingMeng， Ge Lou.miR-137 suppresses cell growth in ovarian cancer by targeting AEG-1[J].Biochemical and Biophysical Research Communications， 2013， 441： 357–363
[4] 林丽娜，陈为，王伟民，等.miR-137 对U87 胶质瘤细胞中EZH2 表达和细胞增殖的影响[J]. 中国微侵袭神经外科杂志. 2011， 16（8）：362-365.
[5] 温锦荣，趁灵朝，王韩兵，等. Mir-137调控人脑胶质瘤细胞增殖侵袭能力的体外研究[J]. 中国微侵袭神经外科杂志，2013，18（3）：129-132.
[6] Yan Cheng， Yang Li， Dong Liu， Rong Zhang， Jun Zhang. miR-137 effects on gastric carcinogenesis are mediated by targetingCox-2-activated PI3K/AKT signaling pathway[J]. FEBS Letters， 2014， 588：3274–3281
[7] Sheng Liu， Juan Cui ，GuoqingLiao，YiZhang，Ke Ye ，Tailiang Lu， Jing Qi，Guohui Wan. miR-137 regulates epithelial-mesenchymaltransitionin gastrointestinal stromal tumor[J].Tumor Biol. 2014， 35：9131–9138
[8] 潘秋衛，蔡荣，刘新桓，等. microRNA与肿瘤发生[J].中国肿瘤临床， 2011， 38（7）： 411-414.
[9] Yi R， Poy M N， Stoffel M， Fuchs E. A skin microRNA promotes differentiation by repressing 'stemness'[J]. Nature， 2008， 452： 225-229.
[10] Xiaolan Zhu， Yuefeng Li， HuilingShen et al. miR-137 inhibits the proliferation of lung cancer cellsby targeting Cdc42 and Cdk6[J]. FEBS Letters， 2013， 587：73–81.
[11] Jemal A， Bray F， Center MM， et al. Global cancer statistics[J]. CACancer J Clin， 2011， 61（2）： 69-90.
[12] 李炎，程鹏. 中晚期肝癌临床治疗进展[J].临床肝胆病杂志，2014，30（3）：233-236
作者简介：李琴（1985-），女，
摘要：目的 探究mir-137在正常肝细胞与肝癌细胞之间的表达差异及其对肝癌细胞HEP3B生物学行为的影响。方法 采用实时荧光定量PCR检测正常细胞与肝癌细胞中mir-137的表达差异。利用CCK-8方法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布差异，transwell检测细胞体外侵袭能力，划痕修复方法检测细胞迁移能力。结果 mir-137在正常肝细胞与肝癌细胞中具有显著差异，可抑制细胞增殖、侵袭及迁移能力；促进细胞的凋亡，使细胞周期阻滞在G1期。
关键词：mir-137；肝癌细胞；增殖；周期；凋亡；侵袭；迁移
Mir137定位于1P22的AK094607基因中，在结肠癌、卵巢癌、胃癌等癌症中扮演着抑癌基因的角色[1-3]。本文就mir137在肝癌细胞中的表达差异，及其对肝癌细胞增殖和周期凋亡的调节作用进行研究。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 正常肝细胞HL-7702， 肝癌细胞HUH7、HEPG2、HCC-LM3、MHCC-97H、MHCC-97L、HEP3B、SMCC-7721（购自中科院上海或昆明细胞库）。
1.1.2 主要试剂 胎牛血清（BI）；胰酶（GIBCO）；DMEM（corning）；PBS（amerosco）Lipofectamin 2000转染试剂（Invitrogen）；Trizol（invitrogen）；实时荧光定量通用试剂（Cat# GMRS-001吉玛）；CCK-8试剂盒（东仁化学）；PI（sigma）；FITC-PI凋亡试剂盒（美季生物）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养、转染及实验分组 HL-7702、HUH7、HEPG2、HCC-LM3、MHCC-97H、MHCC-97L、HEP3B、SMCC-7721常规以10%FBS胎牛血清的DMEM培养液，置于37?C 5% CO2培养箱中培养。 HEP3B细胞根据lipo2000的说明书进行转染，最终mir-137 mimics终浓度为20nM。转染后继续培养24-48h，进行后续实验。
1.2.2 RNA抽提、逆转录及荧光定量PCR 使用Trizol方法提取细胞的总RNA，CDNA的逆转录按照试剂盒进行。 Mir-137上游引物序列为5，- CCATTCATTCGTTATTGCTTAAGA-3，，下游为5，- TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC -3，。按PCR试剂盒说明书配置PCR体系。采用MX3000P实时荧光定量PCR仪（Stratagene， U.S.），两步法扩展目的片段，以U6为内参，上游序列为5，- ATTGGAACGATACAGAGAAGATT -3，，下游序列为5，- GGAACGCTTCACGAATTTG -3，。 mir137表达量为对照，基因的相对表达量=2-??Ct（?Ct=目的基因Ct-内参基因Ct）。
1.2.3 细胞增殖实验 HEP3B细胞接种96孔板，用于细胞转染。分别于转染前、转染后24、48、72小时，倾去培养液，加入新鲜的培养基100μl，每孔避光加入CCK8 10μl，避光培养2.5小时，酶标仪（thermo）450nm波长测OD值。
1.2.4细胞周期、凋亡实验 细胞转染后24h，以不含EDTA胰酶消化，周期组75%乙醇4℃固定过夜。预冷PBS重悬细胞后。加入150 ulRNaseA重悬细胞，37℃消化30分钟。加入100 ul PI工作液，4℃避光染色30分钟。凋亡组按试剂盒说明书，分别以Annexin V-FITC、PI孵育适当时间后，在1 小时内用流式细胞仪检测（BD）。
1.2.5 迁移、侵袭实验 细胞转染后24h，迁移组在孔板中培养至95%融合，用20ul枪头在孔板中均匀画直线横穿过孔，每孔三条。用PBS洗除划下的细胞，加入2%FBS培养基。放入37?C 5% CO2培养箱继续培养， 0h、6h、12h拍照，做数据统计；侵袭组，更换为5%血清的培养基饥饿培养24h。实验前一天铺好matrigel胶（BD），置于培养箱使胶凝固。以胰酶消化后，上室加入5%血清含量的200ul细胞悬液，下室加入15%血清含量的700ul培养基。48h后，取出小室，用棉签擦去上层未过膜的细胞，PBS洗三遍。4%多聚甲醛室温固定30min。PBS洗三遍，风干后加入结晶紫，染色30min。显微镜下拍照，做数据统计。
1.3 数据统计
所有数据采用Graphpad prism 5.0进行统计分析，数值变量采用x±s进行，均数采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 肝癌细胞与正常细胞中mir-137表达差异：荧光定量PCR检测结果显示，肝癌细胞中的mir-137表达量显著低于正常肝细胞。见图1
2.2 mir-137 mimics抑制细胞增殖：CCK-8细胞增殖实验显示，上调mir-137的表达后，实验组的增殖速率明显低于对照组，mir-137 mimics对细胞增殖具有抑制作用。见图1
2.3上调mir-137促进细胞凋亡，使细胞阻滞在G1期：Mir-137 mimics转染细胞与对照组比较，细胞的凋亡率明显增高。细胞周期分布也发生了改变，mir-137 mimics组细胞阻滞于G1期，而S期细胞比例有所下降。见图1
2.4 mir-137的表达影响肝癌细胞的迁移及侵袭能力：与对照组相比，mir-137 mimics组划痕愈合速度减慢。Transwell侵袭实验中，对照组的过膜细胞数，明显多于mir-137 mimics组。见图1 3 讨论
MicroRNA 是一类由内源基因编码的长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与了人体几乎所有的细胞进程的调控。研究显示mir137在多种肿瘤细胞中表达异常，与肿瘤的增殖、侵袭、周期等功能密切相关。通过靶向不同的基因，mir-137在多种肿瘤细胞中，调控细胞的增殖、侵袭、迁移等重要功能[4-10]。
肝癌作为常见的恶性肿瘤之一[11]，随着时代的发展，其发病因素也由早期的环境因素发展为复杂的多方面因素综合影响。积极预防及早期的诊治、治疗仍为提高肝癌预后及生存率的主要方法。目前，肝癌中晚期的治疗方式有：血管介入治疗，分子靶向及化疗药物治疗，放射治疗和局部消融治疗[12]。其中分子靶向治疗作为一种全新的治疗方法，正在逐渐兴起，已商业化的靶向治疗药物有索拉菲尼等。靶向治疗是以肿瘤细胞的某个特异性受体、基因或是特有的分子为靶点进行特异性阻断，从而达到抑制肿瘤生长的目的。
本文实验结果显示，通过上调mir-137在肝癌细胞中的表达，可明显抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡，使细胞分裂阻滞在G1期，并降低肝癌细胞的迁移及侵袭能力。由此可以推断，mir-137在肝癌细胞中扮演着抑癌基因的角色。类似的情况也出现在卵巢癌、胃癌、结肠癌等肿瘤细胞中[4-10]，Mir-137可通过靶向不同的基因实现其抑癌基因的功能。Mir-137在肝癌细胞中通过靶向哪个基因实现其功能，该基因是否有可能成为新的肝癌细胞分子治疗靶点，值得后期深入的研究。
参考文献
[1] 张炎，虞积耀，郭世伟，王育红. 靶向肝素酶基因的microRNA在胃癌中的表达[J]. 第二军医大学学报. 2012，33（2）：200-203.
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[7] Sheng Liu， Juan Cui ，GuoqingLiao，YiZhang，Ke Ye ，Tailiang Lu， Jing Qi，Guohui Wan. miR-137 regulates epithelial-mesenchymaltransitionin gastrointestinal stromal tumor[J].Tumor Biol. 2014， 35：9131–9138
[8] 潘秋衛，蔡荣，刘新桓，等. microRNA与肿瘤发生[J].中国肿瘤临床， 2011， 38（7）： 411-414.
[9] Yi R， Poy M N， Stoffel M， Fuchs E. A skin microRNA promotes differentiation by repressing 'stemness'[J]. Nature， 2008， 452： 225-229.
[10] Xiaolan Zhu， Yuefeng Li， HuilingShen et al. miR-137 inhibits the proliferation of lung cancer cellsby targeting Cdc42 and Cdk6[J]. FEBS Letters， 2013， 587：73–81.
[11] Jemal A， Bray F， Center MM， et al. Global cancer statistics[J]. CACancer J Clin， 2011， 61（2）： 69-90.
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作者简介：李琴（1985-），女，