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摘要：从采集自我国6个省（市）具有根腐症状的绿豆植株中分离得到73株分离菌株，进一步通过离体叶片接种检测获得54株致病菌株。通过形态学和保守序列分析共鉴定出14种致病病原菌，其中尖孢镰刀菌检出率最高，首次检测出群结腐霉可以侵染绿豆并引起根腐症状。对来自国内外12个绿豆品种进行群结腐霉接种试验，结果表明，群结腐霉对不同绿豆品种均表现出强致病力，病情指数在45～96之间;进一步分析表明，皖绿2号对群结腐霉表现出相对较强的抗性水平。
关键词：绿豆;根腐病;病原菌分离;群结腐霉;抗病性;致病力
绿豆由于其生育期短、耐贫瘠、适应性强的特点，在用地养地及农业可持续发展等方面具有重要作用。同时绿豆是我国传统的杂粮作物，因其经济利用价值高，属高蛋白、低脂肪、中淀粉、医食同源作物，是人们理想的营养保健食品。2016年，农业部发布的《全国种植业结构调整规划（2016—2020）》为我国杂粮小品种发展成为大产业、带动农民增收指明了方向。2017年的“中央一号”文件也明确提出，增加我国杂粮等优质农产品供给。在政策导向、种植业结构调整以及人们饮食观念改变的影响下，绿豆种植面积也在逐年增加，目前，我国绿豆常年种植面积超过66.67万hm2（http：//www.moa.gov.cn/）。隨着我国绿豆种植面积的扩大、重茬和迎茬，绿豆病虫害也随之逐渐加剧，进而严重影响了绿豆产量和品质。
绿豆生育期主要病害有苗期的根腐病，花荚期的枯萎病、叶斑病、病毒病、白粉病等。其中绿豆根腐病是一种由多种病原菌混合感染引起的土传病害，病害发生在种子萌发后整个生育阶段[1-2]。2014—2015年调查发现，在黑龙江西部地区绿豆种植区根腐病发病普遍[3]，给绿豆生产带来严重危害。
本研究利用形态学和分子生物学手段对绿豆根腐病致病菌进行分离、鉴定，以期为后续研究该病害的发生规律、制定综合防治措施提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病样采集和病原菌分离纯化
2019年7—9月，在国家食用豆产业技术体系研究人员帮助下，分别从位于河北省石家庄市、黑龙江省齐齐哈尔市、重庆市潼南县、辽宁省沈阳市、河南省南阳市和内蒙古呼和浩特市的绿豆种植田块采集植株矮小，茎基部表现细缩，出现水渍、腐烂症状、褐色病斑的发病植株。
田间采集到的新鲜病株用自来水冲洗干净，并用手术刀在茎基部的病健交界处切取大小约 0.5 cm×0.5 cm的组织小块。组织样本放入70%乙醇中处理30 s进行表面消毒，然后移入2%次氯酸钠溶液中处理10 min，最后以灭菌水冲洗5～7遍并用灭菌滤纸吸干组织表面水分。处理好的组织放置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，然后在温度为25 ℃的培养箱中培养，待有菌落长出取边缘菌丝纯化2次后接种于PDA培养基斜面上保存。
1.2 致病性测定
从生长3周的绿豆苏绿1号植株上选取生长状态一致的三出复叶，切下后正面朝上置于保湿托盘中，叶柄处用湿润脱脂棉球包裹用于保湿。叶片中心位置区域用0.05%吐温溶液处理，消除叶片表面张力，用灭菌水冲洗后再用1mL注射器在处理区域中心位置针刺创伤。从培养4 d的菌落边缘切取大小约4 mm×4 mm的菌丝块，贴在上述叶片创伤处。每个分离菌株接种10张叶片。接种完毕后用保鲜膜密封保湿，置于温度为25 ℃的培养箱中暗培养，每隔24 h观察1次叶片发病状况。待接种叶片发病后，根据柯赫氏法则（Koch postulates）对病原菌进行再分离。
1.3 病原菌形态学观察
将分离得到的致病病原菌接种到PDA培养基中培养7 d，记录菌落颜色和形态特征并拍照。挑取边缘菌丝制作临时切片，在光学显微镜（Olympus CX41）下观察病原菌形态特征，结合菌落在PDA培养基上的形态和颜色特征，参照《真菌鉴定手册》判定病原菌种类。
1.4 病原菌分子生物学鉴定
从培养7 d的PDA平板表面刮取病原菌菌丝，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取病原菌总DNA[4]。分别采用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4，β-tubulin（TUBUF2_F/TUBUF1_R），Histone 3（H3-1a/H3-1b），EF1α（EF1-728F/EF1-986R）（表1）对病原菌DNA进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证条带大小正确后送南京擎科生物科技有限公司测序。将测序结果在Genbank数据库中进行blast同源比对，与已报道病原菌的核酸序列进行比较，结合形态观察结果确定病原菌种类。
1.5 群结腐霉菌接种物制备
分离得到的群结腐霉菌（Pythium myriotylum）菌株CQ19-1（PmCQ19-1）首先在PDA培养基上活化培养4 d。接种体制备参照Kirkpatrick等的方法略加改动：从边缘切取约1 cm×1 cm大小的菌丝块，放置10个菌丝块到含有灭菌细沙-玉米粉培养基（200 mL细沙，11.2 mL玉米粉，80 mL灭菌水）的500 mL三角瓶中，然后置于温度为25 ℃培养箱中培养10 d，期间每天摇匀培养基以保证菌丝在培养基中分布均匀。收集培养物与蛭石按1 ∶ 4体积比混匀作为接种物备用[5]。
1.6 群结腐霉菌接种
绿豆接种参照Kirkpatrick等的方法：取250 mL一次性塑料杯底部打孔排水，装入约150 mL蛭石，然后平铺厚度为1 cm（约40 mL）的群结腐霉菌培养物[5-6]。挑选籽粒饱满的绿豆种子每盆放置10粒于菌丝培养物表面，然后覆盖50 mL蛭石。未培养菌丝的细沙-玉米粉培养基按同样比例混合后作为空白对照，每个品种接种3盆。浇水至蛭石饱和后，放置于25 ℃、16 h—8 h光照—黑暗条件下培养，培养期间及时浇水保证蛭石处于水分饱和状态。 1.7 不同绿豆品种对群结腐霉菌的抗性评价
抗病表型数据记录采用以下方案：分别于播种后7、14 d统计植株存活率;并于14 d小心拔出植株，用自来水冲洗干净根部蛭石，记录不同绿豆品种的发病等级。发病分级按以下标准进行统计：（1）整个根系生长健康，无发病症状;（2）侧根可见轻微腐烂症状，1%～20%的根系组织表现出症状;（3）侧根腐烂症状明显，同时主根开始表现出发病症状，21%～75%的根系组织表现出症状;（4）主根及侧根均出现明显腐烂症状，76%～100%的根系组织腐烂;（5）种子腐烂不萌发[6]。病情指数按以下公式计算：
病情指数=∑（各级发病株数×发病等级数值）/（植株总数×最高发病等级数值）×100。
不同品种间抗病水平差异显著性分析采用Fisher氏最小显著差数检验（LSD）法进行多重比较，显著水平以P
关键词：绿豆;根腐病;病原菌分离;群结腐霉;抗病性;致病力
绿豆由于其生育期短、耐贫瘠、适应性强的特点，在用地养地及农业可持续发展等方面具有重要作用。同时绿豆是我国传统的杂粮作物，因其经济利用价值高，属高蛋白、低脂肪、中淀粉、医食同源作物，是人们理想的营养保健食品。2016年，农业部发布的《全国种植业结构调整规划（2016—2020）》为我国杂粮小品种发展成为大产业、带动农民增收指明了方向。2017年的“中央一号”文件也明确提出，增加我国杂粮等优质农产品供给。在政策导向、种植业结构调整以及人们饮食观念改变的影响下，绿豆种植面积也在逐年增加，目前，我国绿豆常年种植面积超过66.67万hm2（http：//www.moa.gov.cn/）。隨着我国绿豆种植面积的扩大、重茬和迎茬，绿豆病虫害也随之逐渐加剧，进而严重影响了绿豆产量和品质。
绿豆生育期主要病害有苗期的根腐病，花荚期的枯萎病、叶斑病、病毒病、白粉病等。其中绿豆根腐病是一种由多种病原菌混合感染引起的土传病害，病害发生在种子萌发后整个生育阶段[1-2]。2014—2015年调查发现，在黑龙江西部地区绿豆种植区根腐病发病普遍[3]，给绿豆生产带来严重危害。
本研究利用形态学和分子生物学手段对绿豆根腐病致病菌进行分离、鉴定，以期为后续研究该病害的发生规律、制定综合防治措施提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病样采集和病原菌分离纯化
2019年7—9月，在国家食用豆产业技术体系研究人员帮助下，分别从位于河北省石家庄市、黑龙江省齐齐哈尔市、重庆市潼南县、辽宁省沈阳市、河南省南阳市和内蒙古呼和浩特市的绿豆种植田块采集植株矮小，茎基部表现细缩，出现水渍、腐烂症状、褐色病斑的发病植株。
田间采集到的新鲜病株用自来水冲洗干净，并用手术刀在茎基部的病健交界处切取大小约 0.5 cm×0.5 cm的组织小块。组织样本放入70%乙醇中处理30 s进行表面消毒，然后移入2%次氯酸钠溶液中处理10 min，最后以灭菌水冲洗5～7遍并用灭菌滤纸吸干组织表面水分。处理好的组织放置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，然后在温度为25 ℃的培养箱中培养，待有菌落长出取边缘菌丝纯化2次后接种于PDA培养基斜面上保存。
1.2 致病性测定
从生长3周的绿豆苏绿1号植株上选取生长状态一致的三出复叶，切下后正面朝上置于保湿托盘中，叶柄处用湿润脱脂棉球包裹用于保湿。叶片中心位置区域用0.05%吐温溶液处理，消除叶片表面张力，用灭菌水冲洗后再用1mL注射器在处理区域中心位置针刺创伤。从培养4 d的菌落边缘切取大小约4 mm×4 mm的菌丝块，贴在上述叶片创伤处。每个分离菌株接种10张叶片。接种完毕后用保鲜膜密封保湿，置于温度为25 ℃的培养箱中暗培养，每隔24 h观察1次叶片发病状况。待接种叶片发病后，根据柯赫氏法则（Koch postulates）对病原菌进行再分离。
1.3 病原菌形态学观察
将分离得到的致病病原菌接种到PDA培养基中培养7 d，记录菌落颜色和形态特征并拍照。挑取边缘菌丝制作临时切片，在光学显微镜（Olympus CX41）下观察病原菌形态特征，结合菌落在PDA培养基上的形态和颜色特征，参照《真菌鉴定手册》判定病原菌种类。
1.4 病原菌分子生物学鉴定
从培养7 d的PDA平板表面刮取病原菌菌丝，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取病原菌总DNA[4]。分别采用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4，β-tubulin（TUBUF2_F/TUBUF1_R），Histone 3（H3-1a/H3-1b），EF1α（EF1-728F/EF1-986R）（表1）对病原菌DNA进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证条带大小正确后送南京擎科生物科技有限公司测序。将测序结果在Genbank数据库中进行blast同源比对，与已报道病原菌的核酸序列进行比较，结合形态观察结果确定病原菌种类。
1.5 群结腐霉菌接种物制备
分离得到的群结腐霉菌（Pythium myriotylum）菌株CQ19-1（PmCQ19-1）首先在PDA培养基上活化培养4 d。接种体制备参照Kirkpatrick等的方法略加改动：从边缘切取约1 cm×1 cm大小的菌丝块，放置10个菌丝块到含有灭菌细沙-玉米粉培养基（200 mL细沙，11.2 mL玉米粉，80 mL灭菌水）的500 mL三角瓶中，然后置于温度为25 ℃培养箱中培养10 d，期间每天摇匀培养基以保证菌丝在培养基中分布均匀。收集培养物与蛭石按1 ∶ 4体积比混匀作为接种物备用[5]。
1.6 群结腐霉菌接种
绿豆接种参照Kirkpatrick等的方法：取250 mL一次性塑料杯底部打孔排水，装入约150 mL蛭石，然后平铺厚度为1 cm（约40 mL）的群结腐霉菌培养物[5-6]。挑选籽粒饱满的绿豆种子每盆放置10粒于菌丝培养物表面，然后覆盖50 mL蛭石。未培养菌丝的细沙-玉米粉培养基按同样比例混合后作为空白对照，每个品种接种3盆。浇水至蛭石饱和后，放置于25 ℃、16 h—8 h光照—黑暗条件下培养，培养期间及时浇水保证蛭石处于水分饱和状态。 1.7 不同绿豆品种对群结腐霉菌的抗性评价
抗病表型数据记录采用以下方案：分别于播种后7、14 d统计植株存活率;并于14 d小心拔出植株，用自来水冲洗干净根部蛭石，记录不同绿豆品种的发病等级。发病分级按以下标准进行统计：（1）整个根系生长健康，无发病症状;（2）侧根可见轻微腐烂症状，1%～20%的根系组织表现出症状;（3）侧根腐烂症状明显，同时主根开始表现出发病症状，21%～75%的根系组织表现出症状;（4）主根及侧根均出现明显腐烂症状，76%～100%的根系组织腐烂;（5）种子腐烂不萌发[6]。病情指数按以下公式计算：
病情指数=∑（各级发病株数×发病等级数值）/（植株总数×最高发病等级数值）×100。
不同品种间抗病水平差异显著性分析采用Fisher氏最小显著差数检验（LSD）法进行多重比较，显著水平以P