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[摘要] 目的 探讨辣椒素对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜形态、P物质表达的影响及作用机制。 方法 建立变应性鼻炎动物模型，采用辣椒素滴鼻，记录大鼠喷嚏次数、抓鼻次数、流涕情况评分叠加计分。对比正常组、未治疗组、治疗组鼻黏膜形态，对比治疗后鼻黏膜肥大细胞、P物质含量变化。 结果 治疗后治疗组变应性鼻炎症状明显缓解（P<0.05），治疗组肥大细胞、P物质含量较未治疗组明显减少（P<0.05）。 結论 辣椒素对变应性鼻炎有治疗作用，其作用机制与减少P物质含量、降低IgE介导的I型变态反应相关。
[关键词] 辣椒素；P物质；变应性鼻炎
[中图分类号] R765.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）16-0033-03
[Abstract] Objective To investigate the effect of capsaicin on nasal mucosal morphology and substance P expression in allergic rhinitis rats and its mechanism. Methods Animal model of allergic rhinitis was established. Capsaicin was used intranasally， and the number of sneezes and catching nose， runny nose situation were recorded and scored， and the scores were superimposed. The nasal mucosal morphology among normal group， untreated group and treated group was compared. The changes of nasal mucosa mast cells and substance P content after treatment were compared. Results The symptoms of allergic rhinitis in the treatment group after treatment were significantly relieved（P<0.05）. The nasal mucosa mast cells and the content of substance P in the treatment group were significantly lower than those in the untreated group（P<0.05）. Conclusion Capsaicin has a therapeutic effect on allergic rhinitis， and its mechanism is related to reduce the content of substance P and reducing IgE-mediated type Ⅰ allergic reaction.
[Key words] Capsaicin； Substance P； Allergic rhinitis
近年来研究发现，变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的发生与神经肽如P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）关系密切[1]。这些神经肽与血流量和鼻黏膜腺体的分泌有关，并参与免疫应答的调节[2]。SP可以增强神经兴奋性，若SP大量释放，可引起鼻分泌的亢进[3-4]。辣椒素（capsaicin，CAP）可以选择性消耗神经末梢释放出的神经肽类物质，因此又被称为P物质耗竭剂[5-6]，可以使感觉神经敏感性下降。本研究通过建立AR动物模型观察辣椒素对AR大鼠症状、鼻黏膜形态、P物质表达的影响，从而探讨辣椒素在变应性鼻炎防治中的作用机制。
1 材料与方法
1.1动物及分组
健康雄性SD大鼠[6]30只[动物批号：SCXK（京），2016-0002]，体重180～220 g；饲养条件：宁夏医科大学动物实验中心，无特殊病原体（SPF）；饲养湿度：40%，饲养温度：（22±2）℃。随机分为三组，每组10只，分别为正常对照组（正常组）、变应性鼻炎未治疗组（未治疗组）、变应性鼻炎辣椒素治疗组（治疗组）。应用苦杏仁酸进行标记，用以区别分组。
1.2 药物及试剂
卵清蛋白（Sigma公司生产）、氢氧化铝粉末（Sigma公司生产）、辣椒素（Sigma公司生产）、P物质抗体[艾博抗（上海）贸易有限公司]。
1.3 动物模型建立方法
根据文献[7-9]，建立AR大鼠动物模型：（1）OVA 基础致敏阶段：将卵清蛋白0.3 mg、氢氧化铝粉末30 mg、生理盐水1 mL混合制成混悬液，进行SD大鼠腹腔内注射，每间隔1日进行1次，共注射7次；（2）局部激发阶段：基础致敏阶段结束后，予以2% OVA滴鼻，每侧鼻腔50 μL，每日1次，共行7次滴鼻。
1.4 辣椒素干预
AR动物模型成功后，采用70%乙醇制成3.3 mmol/L的CAP溶液，再用蒸馏水稀释成终浓度为0.656 μmol/L备用。予以辣椒素溶液滴鼻，每侧鼻腔50 μL，每日1次，共15次。正常对照组、变应性鼻炎未干预组以等量生理盐水替代辣椒素溶液，方法及步骤不变。
1.5 标本获取及处理
1.5.1 获取血液标本 在CAP溶液及生理盐水最后一次鼻腔治疗24 h内，将SD大鼠按照10%水合氯醛300 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉后，暴露并分离腹主动脉，抽取动脉血5 mL，放入无菌EP管中，静置1 h之后，于4℃环境下以3000 r/min转速用离心机离心15 min后获得上层血清，置于-20℃冰箱内保存。 1.5.2 获取鼻黏膜组织标本 将取血后的大鼠迅速处死并切取头部，取鼻中隔黏膜，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋，制作切片。（1）常规HE染色，观察鼻黏膜形态。（2）甲苯胺蓝染色：肥大细胞计数。（3）免疫组织化学染色：常规脱蜡、水化、抗原修复（采用微波炉加热法）、封闭、一抗孵育（一抗为免疫P物质抗血清）、二抗孵育（二抗为生物素标记的羊抗兔血清）、显色、复染、分化、脱水、透明、封片，4℃保存。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有高度统计学意义。
2 结果
2.1各组SD大鼠症状学评分结果
未治疗组与治疗组大鼠于末次鼻腔激发后30 min内均出现打喷嚏、流清涕、易怒好动、骚鼻、挠痒等现象，症状学评分>5分。未治疗组出现症状10只，治疗组出现症状10只，两组均造模成功，正常组未出现打喷嚏等AR表现。各组大鼠末次激发后症状评分比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
辣椒素治疗15 d后再次观察记录上述打喷嚏、流清涕等AR症状，未治疗组症状明显缓解为2只（20%），治疗组症状明显缓解为8只（80%），差异有统计学意义（P<0.05）。各组治疗后症状评分比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.2 HE染色
正常组：黏膜形态正常，炎症细胞少见。未治疗组：黏膜连续性中断，纤毛出现倒伏甚至脱落，炎症细胞明显浸润。治疗组：黏膜上皮损伤情况明显好转，炎症细胞明显减少。见封三图2。
2.3 甲苯胺蓝染色
未治疗组肥大细胞计数较正常组增多，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗组肥大细胞计数较未治疗组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图3及表3。
2.4 免疫组织化学染色
治疗组较未治疗组SP表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图4及表4。
3 讨论
AR主要是吸入过敏原后产生的一种特异性反应，目前理论认为这是一种IgE介导的Ⅰ型变态反应[10-11]。抗原激活浆细胞后产生IgE，并与肥大细胞结合，当抗原再次侵入时，致使肥大细胞脱颗粒，产生多种介质，主要有组胺、蛋白酶、白三烯等，其引起血管扩张、液体渗出增加、腺体分泌亢进[12]等反应。SP是NANC神经递质，作为鼻部异样感及反射神经的一个重要媒介，鼻黏膜受到刺激时，SP释放增加，使得血管扩张、黏膜水肿、血浆外溢[13]。因此，SP对鼻黏膜环境的改变至关重要。SP和一些神经递质、细胞因子在神经-免疫系统中的信息转移中起作用，它们可以整合SP及其受体表达[14]。在炎症反应中，炎症细胞和介质激活来自周围感觉神经末梢的SP，导致炎症组织SP的表达增加，并且还可以通过自分泌SP增强炎症反应。本次实验研究表明，辣椒素治疗组SP表达减少，而此次实验大鼠所处的鼻炎阶段为早期。早期变应性鼻炎反应发生在过敏原暴露的几分钟内，并且特征为打喷嚏、鼻痒和水性鼻涕，其主要由肥大细胞和嗜碱性细胞分泌的化学介质引起。本结果可以解释为将辣椒素滴鼻可使致敏的大鼠减轻鼻神经源性炎症的发展。
本研究发现连续辣椒素治疗15 d，治疗组鼻腔黏膜SP含量显著降低，接近正常水平。未治疗组鼻黏膜SP含量明显高于正常对照组，提示SP在AR的发病中可能发挥了重要的作用。实验表明，辣椒素能促进SP的大量释放，引起鼻分泌增多，血管扩张，血流量增多。当反复多次大剂量应用辣椒素能使SP耗竭、SP能神经变性和阻滞。为此，我们将辣椒素作为SP能神经阻滞剂，通过对AR治疗作用的观察，证实辣椒素减低了AR实验动物鼻部对变应原的超敏反应性。SP能神经的轴索反射机制可能在AR中发挥作用，已有实验初步表明此机制与P物质能神经末梢的逆向传导有关[15]。
综上所述，通过本次实验，SD大鼠的辣椒素治疗是成功的，同时初步探讨了其可能的作用机制，希望能够为CAP应用于AR的临床治疗提供理论参考。
[参考文献]
[1] 杨莎莎，刘洋，李昕蓉，等.神经肽与肥大细胞之间的交互對变应性鼻炎发病机制的影响[J].辽宁中医杂志，2016，（12）：2512-2515.
[2] Cavazza A，Claudio C，Mario M，et al.Capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry for the evaluation of substance P enzymatic degradation by SaOS-2 human osteosarcoma[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879（25）：2501-2506.
[3] Graepel R，Bodkin JV，Brain SD.Reactive oxygen species（ROS）and the sensory neurovascular component[M]//Studies on Cardiovascular Disorders，Humana Press，2010：87-107.
[4] Substance P[M].Springer Berlin Heidelberg，2015.
[5] Srinivasan K.Biological activities of red pepper（Capsicum annuum）and its pungent principle capsaicin：A review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2016，56（9）：1488. [6] 胡红芳. 鼻炎清颗粒治疗变应性鼻炎的免疫机制研究[J].中国现代医生，2015，53（4）：17-19.
[7] Bernstein JA，Davis BP，Picard JK，et al.A randomized，double-blind，parallel trial comparing capsaicin nasal spray with placebo in subjects with a significant component of nonallergic rhinitis[J].Ann Allergy Asthma Immunol，2011，107（2）：171-178.
[8] 栾兆磊，王雨农，王洪田.变应性鼻炎动物模型的研究进展[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，（13）：1090-1094.
[9] 刘文军，龚龙岗，罗艳，等.对我国变应性鼻炎动物实验研究的评价与思考[J].中国耳鼻咽喉头颈外科，2016， 23（2）：115-117.
[10] 曾斌，刘洋，李昕蓉，等.变应性鼻炎豚鼠动物模型文献研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2016，18（2）：323-327.
[11] Pawankar R，Mori S，Ozu C，et al. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis[J]. Asia Pacific Allergy，2011，1（3）：157.
[12] 中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015年，天津）[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，51（1）：6-24.
[13] Ramírezjiménez F，Pavónromero G，Juarezmartinez L，et al.Allergic rhinitis[J].Journal of Allergy
[关键词] 辣椒素；P物质；变应性鼻炎
[中图分类号] R765.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）16-0033-03
[Abstract] Objective To investigate the effect of capsaicin on nasal mucosal morphology and substance P expression in allergic rhinitis rats and its mechanism. Methods Animal model of allergic rhinitis was established. Capsaicin was used intranasally， and the number of sneezes and catching nose， runny nose situation were recorded and scored， and the scores were superimposed. The nasal mucosal morphology among normal group， untreated group and treated group was compared. The changes of nasal mucosa mast cells and substance P content after treatment were compared. Results The symptoms of allergic rhinitis in the treatment group after treatment were significantly relieved（P<0.05）. The nasal mucosa mast cells and the content of substance P in the treatment group were significantly lower than those in the untreated group（P<0.05）. Conclusion Capsaicin has a therapeutic effect on allergic rhinitis， and its mechanism is related to reduce the content of substance P and reducing IgE-mediated type Ⅰ allergic reaction.
[Key words] Capsaicin； Substance P； Allergic rhinitis
近年来研究发现，变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的发生与神经肽如P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）关系密切[1]。这些神经肽与血流量和鼻黏膜腺体的分泌有关，并参与免疫应答的调节[2]。SP可以增强神经兴奋性，若SP大量释放，可引起鼻分泌的亢进[3-4]。辣椒素（capsaicin，CAP）可以选择性消耗神经末梢释放出的神经肽类物质，因此又被称为P物质耗竭剂[5-6]，可以使感觉神经敏感性下降。本研究通过建立AR动物模型观察辣椒素对AR大鼠症状、鼻黏膜形态、P物质表达的影响，从而探讨辣椒素在变应性鼻炎防治中的作用机制。
1 材料与方法
1.1动物及分组
健康雄性SD大鼠[6]30只[动物批号：SCXK（京），2016-0002]，体重180～220 g；饲养条件：宁夏医科大学动物实验中心，无特殊病原体（SPF）；饲养湿度：40%，饲养温度：（22±2）℃。随机分为三组，每组10只，分别为正常对照组（正常组）、变应性鼻炎未治疗组（未治疗组）、变应性鼻炎辣椒素治疗组（治疗组）。应用苦杏仁酸进行标记，用以区别分组。
1.2 药物及试剂
卵清蛋白（Sigma公司生产）、氢氧化铝粉末（Sigma公司生产）、辣椒素（Sigma公司生产）、P物质抗体[艾博抗（上海）贸易有限公司]。
1.3 动物模型建立方法
根据文献[7-9]，建立AR大鼠动物模型：（1）OVA 基础致敏阶段：将卵清蛋白0.3 mg、氢氧化铝粉末30 mg、生理盐水1 mL混合制成混悬液，进行SD大鼠腹腔内注射，每间隔1日进行1次，共注射7次；（2）局部激发阶段：基础致敏阶段结束后，予以2% OVA滴鼻，每侧鼻腔50 μL，每日1次，共行7次滴鼻。
1.4 辣椒素干预
AR动物模型成功后，采用70%乙醇制成3.3 mmol/L的CAP溶液，再用蒸馏水稀释成终浓度为0.656 μmol/L备用。予以辣椒素溶液滴鼻，每侧鼻腔50 μL，每日1次，共15次。正常对照组、变应性鼻炎未干预组以等量生理盐水替代辣椒素溶液，方法及步骤不变。
1.5 标本获取及处理
1.5.1 获取血液标本 在CAP溶液及生理盐水最后一次鼻腔治疗24 h内，将SD大鼠按照10%水合氯醛300 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉后，暴露并分离腹主动脉，抽取动脉血5 mL，放入无菌EP管中，静置1 h之后，于4℃环境下以3000 r/min转速用离心机离心15 min后获得上层血清，置于-20℃冰箱内保存。 1.5.2 获取鼻黏膜组织标本 将取血后的大鼠迅速处死并切取头部，取鼻中隔黏膜，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋，制作切片。（1）常规HE染色，观察鼻黏膜形态。（2）甲苯胺蓝染色：肥大细胞计数。（3）免疫组织化学染色：常规脱蜡、水化、抗原修复（采用微波炉加热法）、封闭、一抗孵育（一抗为免疫P物质抗血清）、二抗孵育（二抗为生物素标记的羊抗兔血清）、显色、复染、分化、脱水、透明、封片，4℃保存。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有高度统计学意义。
2 结果
2.1各组SD大鼠症状学评分结果
未治疗组与治疗组大鼠于末次鼻腔激发后30 min内均出现打喷嚏、流清涕、易怒好动、骚鼻、挠痒等现象，症状学评分>5分。未治疗组出现症状10只，治疗组出现症状10只，两组均造模成功，正常组未出现打喷嚏等AR表现。各组大鼠末次激发后症状评分比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
辣椒素治疗15 d后再次观察记录上述打喷嚏、流清涕等AR症状，未治疗组症状明显缓解为2只（20%），治疗组症状明显缓解为8只（80%），差异有统计学意义（P<0.05）。各组治疗后症状评分比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.2 HE染色
正常组：黏膜形态正常，炎症细胞少见。未治疗组：黏膜连续性中断，纤毛出现倒伏甚至脱落，炎症细胞明显浸润。治疗组：黏膜上皮损伤情况明显好转，炎症细胞明显减少。见封三图2。
2.3 甲苯胺蓝染色
未治疗组肥大细胞计数较正常组增多，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗组肥大细胞计数较未治疗组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图3及表3。
2.4 免疫组织化学染色
治疗组较未治疗组SP表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图4及表4。
3 讨论
AR主要是吸入过敏原后产生的一种特异性反应，目前理论认为这是一种IgE介导的Ⅰ型变态反应[10-11]。抗原激活浆细胞后产生IgE，并与肥大细胞结合，当抗原再次侵入时，致使肥大细胞脱颗粒，产生多种介质，主要有组胺、蛋白酶、白三烯等，其引起血管扩张、液体渗出增加、腺体分泌亢进[12]等反应。SP是NANC神经递质，作为鼻部异样感及反射神经的一个重要媒介，鼻黏膜受到刺激时，SP释放增加，使得血管扩张、黏膜水肿、血浆外溢[13]。因此，SP对鼻黏膜环境的改变至关重要。SP和一些神经递质、细胞因子在神经-免疫系统中的信息转移中起作用，它们可以整合SP及其受体表达[14]。在炎症反应中，炎症细胞和介质激活来自周围感觉神经末梢的SP，导致炎症组织SP的表达增加，并且还可以通过自分泌SP增强炎症反应。本次实验研究表明，辣椒素治疗组SP表达减少，而此次实验大鼠所处的鼻炎阶段为早期。早期变应性鼻炎反应发生在过敏原暴露的几分钟内，并且特征为打喷嚏、鼻痒和水性鼻涕，其主要由肥大细胞和嗜碱性细胞分泌的化学介质引起。本结果可以解释为将辣椒素滴鼻可使致敏的大鼠减轻鼻神经源性炎症的发展。
本研究发现连续辣椒素治疗15 d，治疗组鼻腔黏膜SP含量显著降低，接近正常水平。未治疗组鼻黏膜SP含量明显高于正常对照组，提示SP在AR的发病中可能发挥了重要的作用。实验表明，辣椒素能促进SP的大量释放，引起鼻分泌增多，血管扩张，血流量增多。当反复多次大剂量应用辣椒素能使SP耗竭、SP能神经变性和阻滞。为此，我们将辣椒素作为SP能神经阻滞剂，通过对AR治疗作用的观察，证实辣椒素减低了AR实验动物鼻部对变应原的超敏反应性。SP能神经的轴索反射机制可能在AR中发挥作用，已有实验初步表明此机制与P物质能神经末梢的逆向传导有关[15]。
综上所述，通过本次实验，SD大鼠的辣椒素治疗是成功的，同时初步探讨了其可能的作用机制，希望能够为CAP应用于AR的临床治疗提供理论参考。
[参考文献]
[1] 杨莎莎，刘洋，李昕蓉，等.神经肽与肥大细胞之间的交互對变应性鼻炎发病机制的影响[J].辽宁中医杂志，2016，（12）：2512-2515.
[2] Cavazza A，Claudio C，Mario M，et al.Capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry for the evaluation of substance P enzymatic degradation by SaOS-2 human osteosarcoma[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879（25）：2501-2506.
[3] Graepel R，Bodkin JV，Brain SD.Reactive oxygen species（ROS）and the sensory neurovascular component[M]//Studies on Cardiovascular Disorders，Humana Press，2010：87-107.
[4] Substance P[M].Springer Berlin Heidelberg，2015.
[5] Srinivasan K.Biological activities of red pepper（Capsicum annuum）and its pungent principle capsaicin：A review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2016，56（9）：1488. [6] 胡红芳. 鼻炎清颗粒治疗变应性鼻炎的免疫机制研究[J].中国现代医生，2015，53（4）：17-19.
[7] Bernstein JA，Davis BP，Picard JK，et al.A randomized，double-blind，parallel trial comparing capsaicin nasal spray with placebo in subjects with a significant component of nonallergic rhinitis[J].Ann Allergy Asthma Immunol，2011，107（2）：171-178.
[8] 栾兆磊，王雨农，王洪田.变应性鼻炎动物模型的研究进展[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，（13）：1090-1094.
[9] 刘文军，龚龙岗，罗艳，等.对我国变应性鼻炎动物实验研究的评价与思考[J].中国耳鼻咽喉头颈外科，2016， 23（2）：115-117.
[10] 曾斌，刘洋，李昕蓉，等.变应性鼻炎豚鼠动物模型文献研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2016，18（2）：323-327.
[11] Pawankar R，Mori S，Ozu C，et al. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis[J]. Asia Pacific Allergy，2011，1（3）：157.
[12] 中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015年，天津）[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，51（1）：6-24.
[13] Ramírezjiménez F，Pavónromero G，Juarezmartinez L，et al.Allergic rhinitis[J].Journal of Allergy