【摘 要】
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目的 利用 pGEX-4T-2表达系统表达制备重组人B型钠尿肽(BNP)抗原.方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi : 2172639人BNP DNA序列,设计合成编码BNP-32蛋白的DNA,并分别在5′端和3′端设计BamHI及XhoI位点,经两步聚合酶链反应(PCR)、T-A克隆后,亚克隆至 经BamHI及XhoI 酶切的 pGEX-4T-2 载体,把重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPT
【机 构】
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310016,杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科,310016,杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科,310016,杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院心内科
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目的 利用 pGEX-4T-2表达系统表达制备重组人B型钠尿肽(BNP)抗原.方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi : 2172639人BNP DNA序列,设计合成编码BNP-32蛋白的DNA,并分别在5′端和3′端设计BamHI及XhoI位点,经两步聚合酶链反应(PCR)、T-A克隆后,亚克隆至 经BamHI及XhoI 酶切的 pGEX-4T-2 载体,把重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达, Glutathione sepharose 4B 亲和层析制备GST-BNP.通过DNA测序、融合蛋白的分子量分析和Western-blot来证实GST-BNP质粒及表达的B型钠尿肽(BNP-32)抗原的正确性.结果限制性内切酶和DNA测序结果表明,编码BNP-32的DNA准确插入pGEX-4T-2多克隆位点,成功构建了GST-BNP的表达质粒;诱导表达超声破碎后,GST-BNP蛋白主要存在于上清液中,经亲和层析回收融合蛋白,每升诱导菌可得融合蛋白10.6 mg ;Western-blot证实制备的融合蛋白是人BNP-32.结论通过基因工程技术制备的人BNP抗原,既具有免疫原性又具有反应原性,能很好地解决酶免分析中的基本要素抗原(被检测物)和相应的抗体。
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