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摘 要：建立鸡肉中喹乙醇代谢标识物3-甲基喹恶啉-2-羧酸（MQCA）的高效液相色谱-串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）残留分析方法。样本在一定温度下酶解、盐酸酸化后，用酸乙酯提取，吹干浓缩后再用0.1 %甲酸水溶液 乙腈（V∶V=1∶9）溶解，加入正已烷除杂；以0.1 %甲酸水溶液-乙腈为流动相，经C18柱分离，采用多反应监测（MRM）正离子模式进行检测。实验结果表明，MQCA提取效果好，检出限为0.05 μg/kg，在0.5 μg/kg～5.0 μg/kg添加水平的平均回收率在73.72 %～95.22 %之间，相对标准偏差为1.27 %～2.79 %。本方法适用于鸡肉组织中喹乙醇代谢物残留检测。
关键词：喹乙醇；3-甲基喹恶啉-2-羧酸；高效液相色谱-串联质谱
中图分类号：S859.79 6 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）08-0074-03
喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育灵，在畜禽生产中，能有效地预防疾病，提高饲料利用率，促进代谢，提高氮的沉积，从而促进蛋白质、组织细胞的形成，加速生长，增加经济效益。由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌。因此，喹乙醇在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂。《中国兽药典》（2005版）也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖。但喹乙醇是高效、低成本的抗生素生长促进剂，在一些养殖行业仍在使用，甚至出现滥用，因此建立灵敏、可靠的检测方法对其实施监管十分必要。
3-甲基喹恶啉-2-羧酸是喹乙醇在动物体内产生的代谢物，在体内相对稳定，为喹乙醇代谢残留标识物。MQCA的检测方法已有很多文献报道，其中最常见的是液相色谱法[3，4]和液相色谱-质谱法[1，2，5]，本方法在前人研究工作的基础上，对样本前处理进行了改进，建立了鸡肉中喹乙醇代谢物的UPLC-MS/MS检测方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
AcQuity UPLC/XeVo TQMS液相色谱串联质谱联用仪（美国Waters公司），电子天平（Mettler Toledo公司，型号：PL2002），高速冷冻离心机（SIGMA公司，型号3K15），纯水机（德国Millipore公司），恒温水浴摇床（德国Memmet公司，型号WEN45），MAX（60 mg，3 mL）固相萃取柱（美国Waters公司）。
3-甲基喹恶啉-2-羧酸（MQCA）（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司），3-甲基喹恶啉-2-羧酸-d4（MQCA-d4，加拿大TRC公司），Protease蛋白酶（P5147，美国Sigma公司），Tris碱（T1503，美国Sigma公司）甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Aladdin公司）浓盐酸（优级纯，东江试剂公司）。
标准溶液：精确称取10 mg MQCA标准品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA标准储备液，精确称取1 mg MQCA-d4标准品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL MQCA-d4L标准储备液，-20 ℃以下避光保存。
1.2 样本前处理
取鸡胸及鸡腿肌肉充分绞碎，匀质，-20 ℃以下避光保存。
称取5 g（精确到0.01 g），样本于50 mL离心管中，加入浓度为100 μg/mL 的MQCA-d4内标工作液0.1 mL，加入8 mL 0.2 mol/L pH 9.6 Tris/HCL缓冲溶液和0.3 mL 10 mg/mL蛋白酶水溶液[6]，涡旋混匀，置于恒温水浴摇床47 ℃酶解16 h～18 h，取出样本放至室温，加入10 mL 0.3 mol/L盐酸溶液，振荡5 min，4 ℃、9 000 r/min离心5 min，将上层清液转移至另一干净的50 mL离心管。
加入10 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，4 ℃、 9 000 r/min离心5 min，将上清液转移至另一干净的50 mL离心管。重复乙酸乙酯提取步骤，合并上清液，35 ℃下氮吹浓缩至干，残渣用0.1 %甲酸水溶液 乙腈（V∶V=1∶9）溶解，加入2 mL的正已烷，涡旋1 min，4 ℃、9 000 r/min离心5 min，取下层清液，过0.22 μm滤膜，进样，UPLC-MS/MS测定。
1.3 色谱质谱条件
ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm× 100 mm），柱温40 ℃；流动相为乙腈和0.1 %甲酸水溶液，流速为0.3 mL/mim，采用多反应监测（MRM）模式，分别对MQCA和MQCA-d4标准液进行一级离子扫描，确定化合物的电离方式和分子离子，在获得分子离子峰（母离子）质荷比后，再进行二级质谱（子离子）扫描，优化碰撞能量，确定两个丰度比较高的子离子作为定性和定量离子。在ESI（ ）检测模式下，化合物质谱采集参数（表1）。
空白基质及添加药物样本色谱图见图1和2。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线与定量限
配制MQCA的质量浓度为2.0 μg/L～ 100.0 μg/L的基质匹配的标准工作液，内标浓度均为10.0 μg/L，以目标物峰面积与内标峰面积的比值Y为纵坐标，以标准工作液的浓度X（μg/L）为横坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线（图3）。
以加标样本中待测化合物色谱峰的信噪比等于3对应的浓度为方法检出限，确定鸡肉中的MQCA的检出限为0.05 μg/kg。
2.2 方法回收率实验
分别取鸡肉空白样本，进行加标回收试验，加标浓度分别为 0.5 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg。将加标样本和空白样本按前述方法进行处理，上机测试，结果见表2、表3和表4。
3 讨论与结论
3.1 样本前处理方法的选择
由于MQCA呈弱酸性，水解液经酸化后，才能够被乙酸乙酯提取，赵珊等[1]选择直接加入0.8 mL浓盐酸对MQCA进行酸化，但我们在实验过程中发现：因为浓盐酸有较强腐蚀性，直接加入浓盐酸后，提取液变得很粘稠，离心后，在上清液与残渣之间有一层果冻状凝胶，影响提取效果。对此，我们参考BG/T 20746-2006的方法，经过实验比对，发现加入浓度为1.0 mol/L盐酸溶液8 mL效果最好，回收率高。
文献报道的喹乙醇代谢物的除杂净化都是用不同类型的SPE小柱来实现的，包括活化-上样-淋洗-洗脱等步骤繁琐，耗时[1，5]。我们通过实验比对，发现不过SPE柱，直接用0.1 %甲酸水溶液 乙腈（V∶V=1∶9）溶解浓缩后的残渣后，加入2 mL的正已烷除脂除杂，目标物分离效果好，基质干扰很少，空白基质图谱（图1）及0.5 μg/kg阳性加标色谱图（图2），完全能达到检测要求。因此我们采用直接溶解加正已烷除脂的方法，大大节省了人力、物力。
3.2 结论
本方法建立了鸡肉中喹乙醇的代谢残留标示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的超高压液相色谱-串联质谱的测定方法。样本经过酶解、提取、净化，有效地消除了基质干扰，方法具有较高的灵敏度，以MQCA-d4做为内标，提高了定量准确性。经过优化试验验证，一系列浓度的标准样本溶液（2 μg/L、 5 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L）的标准曲线相关系数r=0.999；方法检出限确定为0.05 μg/kg，亦能达到GB/T 20746-2006检测标准方法中的检出限；在0.5 μg/kg～5.0 μg/kg添加水平的平均回收率在73.72 %～95.22 %之间，相对标准偏差为1.27 %～2.79 %；通过回收率和多种食品样本的实测实验证明：上述方法样本前处理方法简便、快捷、易操作，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，可准确进行定性、定量检测，适用于可食动物肌肉、肝脏中喹乙醇的代谢残留标示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的检测。
参考文献：（6篇，略）
关键词：喹乙醇；3-甲基喹恶啉-2-羧酸；高效液相色谱-串联质谱
中图分类号：S859.79 6 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）08-0074-03
喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育灵，在畜禽生产中，能有效地预防疾病，提高饲料利用率，促进代谢，提高氮的沉积，从而促进蛋白质、组织细胞的形成，加速生长，增加经济效益。由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌。因此，喹乙醇在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂。《中国兽药典》（2005版）也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖。但喹乙醇是高效、低成本的抗生素生长促进剂，在一些养殖行业仍在使用，甚至出现滥用，因此建立灵敏、可靠的检测方法对其实施监管十分必要。
3-甲基喹恶啉-2-羧酸是喹乙醇在动物体内产生的代谢物，在体内相对稳定，为喹乙醇代谢残留标识物。MQCA的检测方法已有很多文献报道，其中最常见的是液相色谱法[3，4]和液相色谱-质谱法[1，2，5]，本方法在前人研究工作的基础上，对样本前处理进行了改进，建立了鸡肉中喹乙醇代谢物的UPLC-MS/MS检测方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
AcQuity UPLC/XeVo TQMS液相色谱串联质谱联用仪（美国Waters公司），电子天平（Mettler Toledo公司，型号：PL2002），高速冷冻离心机（SIGMA公司，型号3K15），纯水机（德国Millipore公司），恒温水浴摇床（德国Memmet公司，型号WEN45），MAX（60 mg，3 mL）固相萃取柱（美国Waters公司）。
3-甲基喹恶啉-2-羧酸（MQCA）（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司），3-甲基喹恶啉-2-羧酸-d4（MQCA-d4，加拿大TRC公司），Protease蛋白酶（P5147，美国Sigma公司），Tris碱（T1503，美国Sigma公司）甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Aladdin公司）浓盐酸（优级纯，东江试剂公司）。
标准溶液：精确称取10 mg MQCA标准品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA标准储备液，精确称取1 mg MQCA-d4标准品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL MQCA-d4L标准储备液，-20 ℃以下避光保存。
1.2 样本前处理
取鸡胸及鸡腿肌肉充分绞碎，匀质，-20 ℃以下避光保存。
称取5 g（精确到0.01 g），样本于50 mL离心管中，加入浓度为100 μg/mL 的MQCA-d4内标工作液0.1 mL，加入8 mL 0.2 mol/L pH 9.6 Tris/HCL缓冲溶液和0.3 mL 10 mg/mL蛋白酶水溶液[6]，涡旋混匀，置于恒温水浴摇床47 ℃酶解16 h～18 h，取出样本放至室温，加入10 mL 0.3 mol/L盐酸溶液，振荡5 min，4 ℃、9 000 r/min离心5 min，将上层清液转移至另一干净的50 mL离心管。
加入10 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，4 ℃、 9 000 r/min离心5 min，将上清液转移至另一干净的50 mL离心管。重复乙酸乙酯提取步骤，合并上清液，35 ℃下氮吹浓缩至干，残渣用0.1 %甲酸水溶液 乙腈（V∶V=1∶9）溶解，加入2 mL的正已烷，涡旋1 min，4 ℃、9 000 r/min离心5 min，取下层清液，过0.22 μm滤膜，进样，UPLC-MS/MS测定。
1.3 色谱质谱条件
ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm× 100 mm），柱温40 ℃；流动相为乙腈和0.1 %甲酸水溶液，流速为0.3 mL/mim，采用多反应监测（MRM）模式，分别对MQCA和MQCA-d4标准液进行一级离子扫描，确定化合物的电离方式和分子离子，在获得分子离子峰（母离子）质荷比后，再进行二级质谱（子离子）扫描，优化碰撞能量，确定两个丰度比较高的子离子作为定性和定量离子。在ESI（ ）检测模式下，化合物质谱采集参数（表1）。
空白基质及添加药物样本色谱图见图1和2。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线与定量限
配制MQCA的质量浓度为2.0 μg/L～ 100.0 μg/L的基质匹配的标准工作液，内标浓度均为10.0 μg/L，以目标物峰面积与内标峰面积的比值Y为纵坐标，以标准工作液的浓度X（μg/L）为横坐标，进行线性回归分析，绘制标准曲线（图3）。
以加标样本中待测化合物色谱峰的信噪比等于3对应的浓度为方法检出限，确定鸡肉中的MQCA的检出限为0.05 μg/kg。
2.2 方法回收率实验
分别取鸡肉空白样本，进行加标回收试验，加标浓度分别为 0.5 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg。将加标样本和空白样本按前述方法进行处理，上机测试，结果见表2、表3和表4。
3 讨论与结论
3.1 样本前处理方法的选择
由于MQCA呈弱酸性，水解液经酸化后，才能够被乙酸乙酯提取，赵珊等[1]选择直接加入0.8 mL浓盐酸对MQCA进行酸化，但我们在实验过程中发现：因为浓盐酸有较强腐蚀性，直接加入浓盐酸后，提取液变得很粘稠，离心后，在上清液与残渣之间有一层果冻状凝胶，影响提取效果。对此，我们参考BG/T 20746-2006的方法，经过实验比对，发现加入浓度为1.0 mol/L盐酸溶液8 mL效果最好，回收率高。
文献报道的喹乙醇代谢物的除杂净化都是用不同类型的SPE小柱来实现的，包括活化-上样-淋洗-洗脱等步骤繁琐，耗时[1，5]。我们通过实验比对，发现不过SPE柱，直接用0.1 %甲酸水溶液 乙腈（V∶V=1∶9）溶解浓缩后的残渣后，加入2 mL的正已烷除脂除杂，目标物分离效果好，基质干扰很少，空白基质图谱（图1）及0.5 μg/kg阳性加标色谱图（图2），完全能达到检测要求。因此我们采用直接溶解加正已烷除脂的方法，大大节省了人力、物力。
3.2 结论
本方法建立了鸡肉中喹乙醇的代谢残留标示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）的超高压液相色谱-串联质谱的测定方法。样本经过酶解、提取、净化，有效地消除了基质干扰，方法具有较高的灵敏度，以MQCA-d4做为内标，提高了定量准确性。经过优化试验验证，一系列浓度的标准样本溶液（2 μg/L、 5 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L）的标准曲线相关系数r=0.999；方法检出限确定为0.05 μg/kg，亦能达到GB/T 20746-2006检测标准方法中的检出限；在0.5 μg/kg～5.0 μg/kg添加水平的平均回收率在73.72 %～95.22 %之间，相对标准偏差为1.27 %～2.79 %；通过回收率和多种食品样本的实测实验证明：上述方法样本前处理方法简便、快捷、易操作，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，可准确进行定性、定量检测，适用于可食动物肌肉、肝脏中喹乙醇的代谢残留标示物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的检测。
参考文献：（6篇，略）