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摘要：目的：研究早期糖尿病肾病大鼠促纤维化相关因子变化，探讨糖尿病肾病纤维化机制。方法：对雄性Wistar大鼠采用高糖高脂饮食配合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法诱导糖尿病肾病大鼠模型。血糖水平>16.7mmol/L 且24h 尿白蛋白>30mg视为造模成功。30只大鼠随机分为正常对照组（NC组）和糖尿病肾病模型组（DN组）。10周后观察各组大鼠体重、肾指数、空腹血糖、血肌酐、血尿素氮、UAER变化；留取肾组织切片观察光镜下病理改变；免疫组化法测定TGF-β1、IV型胶原蛋白和ICAM-1的表达水平。结果：DN组大鼠一般情况、肾指数、生化指标等较NC组明显恶化；免疫组化结果显示TGF-β1、IV型胶原蛋白和ICAM-1在肾脏上皮细胞和肾小球系膜细胞DN组较NC组表达明显增加。结论：实验动物的高血糖状态会损害肾脏组织，高血糖可能通过活化大鼠肾脏组织内TGF-β1、IV型胶原蛋白和ICAM-1，进而促进肾间质结缔组织增生和纤维化，导致肾小球硬化而引起糖尿病肾病。
关键词：糖尿病肾病；转化生长因子β1；IV型胶原蛋白；细胞间粘附分子
糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者常见并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DN 典型的病理改变是肾小球硬化，其组织学特征是肾小管和肾小球基底膜增厚，系膜基质（ECM）扩张、肾肥大以及肾小管间质纤维化[1]。许多学者已证明TGF-β1为致纤维化因子，其表达增多可指导ECM生成，并抑制其降解，在 DN 发病机制的各个环节起着重要的作用。IV 型胶原的合成和分泌增多及降解减少是许多肾脏疾病发展、ECM 积聚、最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化的主要原因或重要参与因素之一。细胞间黏附分子（ICAM-1）是重要的炎症因子，在DN的发生发展中起重要作用，过度表达导致单核细胞/巨噬细胞在肾组织的大量聚集，加重内皮细胞的损伤[2-3]。本实验通过观察了TGF-β1、IV型胶原蛋白和ICAM-1 在链尿佐菌素诱导的糖尿病模型肾脏组织细胞中的表达，对其功能意义和机制进行探讨，并结合肾脏组织HE染色病理学观察，以探讨糖尿病肾病可能的发病机制。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
雄性Wistar大鼠（山西医科大学动物实验中心）；链脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体，兔抗大鼠IV型胶原蛋白，兔抗大鼠细胞间粘附分子（Cell Signaling公司）；免疫组化ElivisionTM plus试剂盒（福建迈新公司）。
1.2 糖尿病肾病动物模型的建立与分组
雄性Wistar大鼠30只，8周龄，体重190～230g，实验前测鼠尾外周血糖均正常。随机分为两组：正常对照组（NC组）10只，实验组20只。将STZ溶于0.1mol/L的无菌枸橼酸钾缓冲液（pH4.4），配成1%的溶液。实验组给予高糖高脂饲料（糖20%，猪油10%，鸡蛋黄10%，普通饲料60%）1月后禁食12h，单次腹腔注射STZ（30mg/kg），48h后尾静脉取血测随机血糖，血糖>16.7mmoL/L并出现多饮、多尿、多食、体重减轻为糖尿病大鼠造模成功，共18只造模成功。继续高糖、高脂喂养6周后测24小时尿蛋白，本实验糖尿病肾病大鼠造模成功纳入标准为24h尿蛋白>30mg，共14只造模成功，随机取10只作为实验组；正常对照组给予普通饲养，尾静脉注射枸橼酸钾缓冲液。成模4周后，各组大鼠禁食12h，称重，腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉后腹腔静脉采血，分离血清，-70℃保存备用。经腹主动脉灌注冷生理盐水至双肾发白后取出，称质量。留取肾组织数小块10%中性甲醛固定后石蜡包埋、染色、电镜观察，其余部分迅速投入液氮中，冻透后储存于-70℃冰箱。
1.3 生化指标检测
成模4周后，腹腔静脉取血，检测血糖、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）；留取24h尿标本，记录尿量，检测24h尿微量白蛋白。
1.4 肾脏组织病理切片观察
取大鼠肾组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3μm.常规脱蜡至水，HE染色，光镜观察。
1.5 免疫组织化学染色
石蜡切片厚3μm，常规脱蜡至水，pH6.0、0.1%柠檬酸缓冲液抗原修复。3%H2O2、5%牛血清白蛋白（BSA）封闭后分别加入一抗（TGF-β1 Collagen IV和ICAM-1），4℃孵育過夜；分别加生物素化羊抗兔IgG抗体及SP复合物，DAB显色，苏木素复染，光镜观察阳性染色颗粒。以PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选择5个高倍镜视野（x400）测定其吸光度值。TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1阳性细胞表现为胞膜及部分胞质呈棕黄色或棕褐色。
1.6 统计学处理
计量资料用均数±标准差表示，计数资料用率表示。组间计量资料的比较采用成组设计的t检验或方差分析，率的比较采用卡方检验或秩和检验。应用 SPSS13.0 统计软件进行数据分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组大鼠一般情况及血糖变化
正常组（NC组）精神状态良好，反应灵敏，动作自如。模型组（DN组）具有糖尿病典型的“三多一少"表现，且精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，弓背蜷体，后期出现腹部肿胀，部分出现感染，溃疡等合并症状。
2.2 各组大鼠肾功能生化指标水平变化
DN组血BUN、SCr水平明显高于NC组（P<0.01）。与NC组比较DN组大鼠血糖、UAER明显升高（P<0.05）。
2.3 各组大鼠肾脏组织形态学改变
光镜下，正常组肾小球系膜区未见明显改变。DN组肾小球基底膜增厚，细胞外基质增多，系膜区扩大，肾小管细胞增生肥大，管腔变窄。挤压毛细血管腔，部分肾小球毛细血管丛出现结节状病变，可见小管上皮细胞肿胀，空泡变性，间质中有灶状淋巴细胞浸润。 2.4 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1免疫组化改变免疫组化切片可见，阳性细胞胞浆染成黄褐色，有TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1表达。阳性细胞主要为肾小球内皮细胞和系膜细胞。NC组大鼠肾小球中未见TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1明显表达，DN组大鼠肾小球中TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1表达较NC组明显增加。
3. 讨论
糖尿病肾病由于长期高血糖的刺激，最终表现为肾脏体积增大和肾小球肥大，同时，由于各种细胞因子的激活，进而出现肾小球基底膜增厚、肾小球胞外基质成份积聚和肾小管间质硬化[4]。而本研究观察到肾小球基底膜增厚，细胞外基质增多，系膜区扩大，肾小管细胞增生肥大，管腔变窄。挤压毛细血管腔，小管上皮细胞肿胀，空泡变性，间质中有灶状淋巴细胞浸润。证实在高血糖状态下，本实验糖尿病大鼠肾脏出现了典型的DN病理结构变化，与文献报道一致。
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见、最严重的慢性并发症之一，其病变可以累及肾组织多种结构，早期表现为肾小球、肾小管肥大，基底膜增厚，系膜基质增生，晚期可发展为弥漫或结节性肾小球硬化，肾小管萎缩及肾间质纤维化，最终导致肾功能衰竭[5]。近年研究表明，在DN的发病环节中，多种细胞因子分泌异常和细胞外基质（ECM）代谢异常起重要作用。TGF-β1是一类多功能调节细胞生长、分化的细胞因子，能刺激多种细胞的增值和分化，调节ECM的代谢平衡，是导致糖尿病肾病肾组织纤维化的主要核心因子[6]。同时，多项研究证实IV型胶原蛋白含量与DN关系密切，且TGF-β1可以促进IV胶原蛋白的表达[7]。ECM包括Ⅲ型胶原蛋白、IV胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白[8-9]。其中IV胶原蛋白是ECM的主要胶原成分，约占基底膜干重的50%，它反映了肾脏细胞外基质胶原蛋白的代谢状态，其合成和降解的异常在糖尿病肾病中起重要作用，是糖尿病肾病时ECM增多的主要成分。由于其合成与降解代谢不平衡，造成肾小球硬化的发生和发展。在早期是以合成增加为主，晚期则是降解减慢为主[10-11]。ICAM-1是一种重要的黏附分子，可促进白细胞与血管内皮细胞的黏附及渗出扩大炎症反应，造成血管病变，导致组织器官发生病理生理的改变[12]。在糖尿病肾脏中，ICAM-1可介导内皮细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞黏附，使炎性细胞游走到肾脏组织，产生细胞因子，增强白细胞的黏附，加重内皮细胞的损伤，造成血管通透性增强蛋白漏出形成蛋白尿并引起细胞外基质沉积肾小球和肾小管间质纤维化[13-14]。
本研究结果表明，TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1表达的增加可能在糖尿病肾病的发生和发展中起一定作用，为防治糖尿病肾病提供了一定的实验依据，而且也为临床上治疗糖尿病肾病的靶点提供了依据。
参考文献：
[1] National Kidney Foundation. Kidney Disease Outcome Quality Initiative. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease：evaluation，classification，and stratification [J]. AmJ Kidney Dis，2002，39：S1-246.
[2] 李佃淳，闻海霞，丛艳等. 厄贝沙坦对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用及对ICAM-1与VCAM-1表达的影响[J]. 微循环学杂志，2009；19：13-16.
[3] Boulbou MS，Koukoulis GN，Makri ED，et al. Circulating adhesion molecules in type 2 diabetes mellitus and hypertension [J]. Int J Cardio，2005；98：39-44.
[4] Najafian B，Alpers CE，Fogo AB. Pathology of human diabetic nephropathy [J]. Contrib Nephrol，2011，170：36-47.
[5] Vallon V. The proximal tubule in the pathophysiology of the diabetic kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011；300：1009-1022.
[6] Forbes JM，Fukami K，Cooper ME. Diabetic nephropathy：where hemodynamics meets metabolism. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2007；115：69-84.
[7] 孟凡東，李伟. 利拉鲁肽对肿瘤坏死因子α刺激下大鼠肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物1和细胞间黏附分子1表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2012，28：715-719.
[8] Qi MY，Kai-Chen，Liu HR，et al. Protective effect of Icariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factor β1 and type IV collagen expression in rats. J Ethnopharmacol. 2011；138：731-736.
[9] 米永杰，文莉莉，李健等.转化生长因子β1活性抑制肽对糖尿病大鼠肾保护的作用[J].广东医学，2011，32：1533-1535.
[10] 周珍，吴小燕，姚涛等. 脂联素及其受体对糖尿病肾病大鼠的保护作用[J].中华肾脏病杂志，2010，26：702-707.
[11] Ju JW，Mu SH，Yin YZ，et al. Effects of zao huang mixture（see text）on the expressions of TGF-beta1 and Col IV in human glomerular mesangial cells cultured in high glucose environment. J Tradit Chin Med. 2011；31：127-129.
[12] 韩艳秋，王嘉欣，崔文鹏等. GSK3β抑制剂对糖尿病肾病大鼠CTGF和ICAM-1的影响[J].中国老年学杂志，2013，33：125-127.
[13] 杨彦，谢春光. 川芎嗪对糖尿病肾病大鼠肾间质巨噬细胞浸润及单核细胞趋化蛋白-1与细胞间黏附分子-1 mRNA表达的影响[J].时珍国医国药，2009，20：275-277.
[14] Wang L，Zhang L，Yu Y，et al. The protective effects of taurine against early renal injury in STZ-induced diabetic rats，correlated with inhibition of renal LOX-1-mediated ICAM-1 expression. Ren Fail. 2008：763-771.
关键词：糖尿病肾病；转化生长因子β1；IV型胶原蛋白；细胞间粘附分子
糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者常见并发症，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DN 典型的病理改变是肾小球硬化，其组织学特征是肾小管和肾小球基底膜增厚，系膜基质（ECM）扩张、肾肥大以及肾小管间质纤维化[1]。许多学者已证明TGF-β1为致纤维化因子，其表达增多可指导ECM生成，并抑制其降解，在 DN 发病机制的各个环节起着重要的作用。IV 型胶原的合成和分泌增多及降解减少是许多肾脏疾病发展、ECM 积聚、最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化的主要原因或重要参与因素之一。细胞间黏附分子（ICAM-1）是重要的炎症因子，在DN的发生发展中起重要作用，过度表达导致单核细胞/巨噬细胞在肾组织的大量聚集，加重内皮细胞的损伤[2-3]。本实验通过观察了TGF-β1、IV型胶原蛋白和ICAM-1 在链尿佐菌素诱导的糖尿病模型肾脏组织细胞中的表达，对其功能意义和机制进行探讨，并结合肾脏组织HE染色病理学观察，以探讨糖尿病肾病可能的发病机制。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
雄性Wistar大鼠（山西医科大学动物实验中心）；链脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体，兔抗大鼠IV型胶原蛋白，兔抗大鼠细胞间粘附分子（Cell Signaling公司）；免疫组化ElivisionTM plus试剂盒（福建迈新公司）。
1.2 糖尿病肾病动物模型的建立与分组
雄性Wistar大鼠30只，8周龄，体重190～230g，实验前测鼠尾外周血糖均正常。随机分为两组：正常对照组（NC组）10只，实验组20只。将STZ溶于0.1mol/L的无菌枸橼酸钾缓冲液（pH4.4），配成1%的溶液。实验组给予高糖高脂饲料（糖20%，猪油10%，鸡蛋黄10%，普通饲料60%）1月后禁食12h，单次腹腔注射STZ（30mg/kg），48h后尾静脉取血测随机血糖，血糖>16.7mmoL/L并出现多饮、多尿、多食、体重减轻为糖尿病大鼠造模成功，共18只造模成功。继续高糖、高脂喂养6周后测24小时尿蛋白，本实验糖尿病肾病大鼠造模成功纳入标准为24h尿蛋白>30mg，共14只造模成功，随机取10只作为实验组；正常对照组给予普通饲养，尾静脉注射枸橼酸钾缓冲液。成模4周后，各组大鼠禁食12h，称重，腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉后腹腔静脉采血，分离血清，-70℃保存备用。经腹主动脉灌注冷生理盐水至双肾发白后取出，称质量。留取肾组织数小块10%中性甲醛固定后石蜡包埋、染色、电镜观察，其余部分迅速投入液氮中，冻透后储存于-70℃冰箱。
1.3 生化指标检测
成模4周后，腹腔静脉取血，检测血糖、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）；留取24h尿标本，记录尿量，检测24h尿微量白蛋白。
1.4 肾脏组织病理切片观察
取大鼠肾组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3μm.常规脱蜡至水，HE染色，光镜观察。
1.5 免疫组织化学染色
石蜡切片厚3μm，常规脱蜡至水，pH6.0、0.1%柠檬酸缓冲液抗原修复。3%H2O2、5%牛血清白蛋白（BSA）封闭后分别加入一抗（TGF-β1 Collagen IV和ICAM-1），4℃孵育過夜；分别加生物素化羊抗兔IgG抗体及SP复合物，DAB显色，苏木素复染，光镜观察阳性染色颗粒。以PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选择5个高倍镜视野（x400）测定其吸光度值。TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1阳性细胞表现为胞膜及部分胞质呈棕黄色或棕褐色。
1.6 统计学处理
计量资料用均数±标准差表示，计数资料用率表示。组间计量资料的比较采用成组设计的t检验或方差分析，率的比较采用卡方检验或秩和检验。应用 SPSS13.0 统计软件进行数据分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组大鼠一般情况及血糖变化
正常组（NC组）精神状态良好，反应灵敏，动作自如。模型组（DN组）具有糖尿病典型的“三多一少"表现，且精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，弓背蜷体，后期出现腹部肿胀，部分出现感染，溃疡等合并症状。
2.2 各组大鼠肾功能生化指标水平变化
DN组血BUN、SCr水平明显高于NC组（P<0.01）。与NC组比较DN组大鼠血糖、UAER明显升高（P<0.05）。
2.3 各组大鼠肾脏组织形态学改变
光镜下，正常组肾小球系膜区未见明显改变。DN组肾小球基底膜增厚，细胞外基质增多，系膜区扩大，肾小管细胞增生肥大，管腔变窄。挤压毛细血管腔，部分肾小球毛细血管丛出现结节状病变，可见小管上皮细胞肿胀，空泡变性，间质中有灶状淋巴细胞浸润。 2.4 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1免疫组化改变免疫组化切片可见，阳性细胞胞浆染成黄褐色，有TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1表达。阳性细胞主要为肾小球内皮细胞和系膜细胞。NC组大鼠肾小球中未见TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1明显表达，DN组大鼠肾小球中TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1表达较NC组明显增加。
3. 讨论
糖尿病肾病由于长期高血糖的刺激，最终表现为肾脏体积增大和肾小球肥大，同时，由于各种细胞因子的激活，进而出现肾小球基底膜增厚、肾小球胞外基质成份积聚和肾小管间质硬化[4]。而本研究观察到肾小球基底膜增厚，细胞外基质增多，系膜区扩大，肾小管细胞增生肥大，管腔变窄。挤压毛细血管腔，小管上皮细胞肿胀，空泡变性，间质中有灶状淋巴细胞浸润。证实在高血糖状态下，本实验糖尿病大鼠肾脏出现了典型的DN病理结构变化，与文献报道一致。
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见、最严重的慢性并发症之一，其病变可以累及肾组织多种结构，早期表现为肾小球、肾小管肥大，基底膜增厚，系膜基质增生，晚期可发展为弥漫或结节性肾小球硬化，肾小管萎缩及肾间质纤维化，最终导致肾功能衰竭[5]。近年研究表明，在DN的发病环节中，多种细胞因子分泌异常和细胞外基质（ECM）代谢异常起重要作用。TGF-β1是一类多功能调节细胞生长、分化的细胞因子，能刺激多种细胞的增值和分化，调节ECM的代谢平衡，是导致糖尿病肾病肾组织纤维化的主要核心因子[6]。同时，多项研究证实IV型胶原蛋白含量与DN关系密切，且TGF-β1可以促进IV胶原蛋白的表达[7]。ECM包括Ⅲ型胶原蛋白、IV胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白[8-9]。其中IV胶原蛋白是ECM的主要胶原成分，约占基底膜干重的50%，它反映了肾脏细胞外基质胶原蛋白的代谢状态，其合成和降解的异常在糖尿病肾病中起重要作用，是糖尿病肾病时ECM增多的主要成分。由于其合成与降解代谢不平衡，造成肾小球硬化的发生和发展。在早期是以合成增加为主，晚期则是降解减慢为主[10-11]。ICAM-1是一种重要的黏附分子，可促进白细胞与血管内皮细胞的黏附及渗出扩大炎症反应，造成血管病变，导致组织器官发生病理生理的改变[12]。在糖尿病肾脏中，ICAM-1可介导内皮细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞黏附，使炎性细胞游走到肾脏组织，产生细胞因子，增强白细胞的黏附，加重内皮细胞的损伤，造成血管通透性增强蛋白漏出形成蛋白尿并引起细胞外基质沉积肾小球和肾小管间质纤维化[13-14]。
本研究结果表明，TGF-β1、Collagen IV和ICAM-1表达的增加可能在糖尿病肾病的发生和发展中起一定作用，为防治糖尿病肾病提供了一定的实验依据，而且也为临床上治疗糖尿病肾病的靶点提供了依据。
参考文献：
[1] National Kidney Foundation. Kidney Disease Outcome Quality Initiative. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease：evaluation，classification，and stratification [J]. AmJ Kidney Dis，2002，39：S1-246.
[2] 李佃淳，闻海霞，丛艳等. 厄贝沙坦对实验性糖尿病大鼠肾脏保护作用及对ICAM-1与VCAM-1表达的影响[J]. 微循环学杂志，2009；19：13-16.
[3] Boulbou MS，Koukoulis GN，Makri ED，et al. Circulating adhesion molecules in type 2 diabetes mellitus and hypertension [J]. Int J Cardio，2005；98：39-44.
[4] Najafian B，Alpers CE，Fogo AB. Pathology of human diabetic nephropathy [J]. Contrib Nephrol，2011，170：36-47.
[5] Vallon V. The proximal tubule in the pathophysiology of the diabetic kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011；300：1009-1022.
[6] Forbes JM，Fukami K，Cooper ME. Diabetic nephropathy：where hemodynamics meets metabolism. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2007；115：69-84.
[7] 孟凡東，李伟. 利拉鲁肽对肿瘤坏死因子α刺激下大鼠肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物1和细胞间黏附分子1表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2012，28：715-719.
[8] Qi MY，Kai-Chen，Liu HR，et al. Protective effect of Icariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factor β1 and type IV collagen expression in rats. J Ethnopharmacol. 2011；138：731-736.
[9] 米永杰，文莉莉，李健等.转化生长因子β1活性抑制肽对糖尿病大鼠肾保护的作用[J].广东医学，2011，32：1533-1535.
[10] 周珍，吴小燕，姚涛等. 脂联素及其受体对糖尿病肾病大鼠的保护作用[J].中华肾脏病杂志，2010，26：702-707.
[11] Ju JW，Mu SH，Yin YZ，et al. Effects of zao huang mixture（see text）on the expressions of TGF-beta1 and Col IV in human glomerular mesangial cells cultured in high glucose environment. J Tradit Chin Med. 2011；31：127-129.
[12] 韩艳秋，王嘉欣，崔文鹏等. GSK3β抑制剂对糖尿病肾病大鼠CTGF和ICAM-1的影响[J].中国老年学杂志，2013，33：125-127.
[13] 杨彦，谢春光. 川芎嗪对糖尿病肾病大鼠肾间质巨噬细胞浸润及单核细胞趋化蛋白-1与细胞间黏附分子-1 mRNA表达的影响[J].时珍国医国药，2009，20：275-277.
[14] Wang L，Zhang L，Yu Y，et al. The protective effects of taurine against early renal injury in STZ-induced diabetic rats，correlated with inhibition of renal LOX-1-mediated ICAM-1 expression. Ren Fail. 2008：763-771.