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摘 要：本文采用高校液相测定了复方桔梗止咳片中甘草酸和甘草苷的含量，固定相为：安捷伦C18（4.6mm×250mm，5um），以乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱为流动相，检测波长为237nm；甘草苷在10～40μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；甘草酸在100～400μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为99.5%、99.8%，RSD为0.69%（n=6）、0.65%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于复方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸的含量测定。
关键词：复方桔梗止咳片；甘草苷；甘草酸
复方桔梗止咳片由桔梗、远志（蜜炙）、款冬花（蜜炙）、甘草等组成。复方桔梗止咳片为黄褐色片；气微香，味甘、微涩，具有镇咳、祛痰的功效。甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的作用。《药性论》记载"：主腹中冷痛，治惊痫，除腹胀满；补益五脏；制诸药毒；养肾气内伤，令人阴（不）痿；主妇人血沥腰痛；虚而多热；加而用之。"甘草常用于脾胃虚弱、，心悸气短、咳嗽痰多、痈肿疮毒、缓解药物毒性等。甘草含有甘草甜素（glycyrrhizin）、甘草酸（glycyrrhinic acid）、甘草次酸（glycyrrhetic acid，glycyrrhetinic acid）、异甘草黄甙（iso-liquiritin）、甘草西定（licoricidin）、甘草醇（glycyrol）、5-0-甲基甘草醇（5-0-methyl glycerol）、异甘草醇（iso-glycyrol）等成分。本文采用高校液相测定了复方桔梗止咳片中甘草酸和甘草苷的含量。
1 仪器与试药
EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）； HH-601超级恒温水浴（江苏金坛市亿通电子有限公司）；320 XT 电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）。
TBL10-250C双频加热型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；Histoon Lab I-05实验室超纯水器（科尔顿（中国）有限公司）；TΜ-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。甘草苷和甘草酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（石家庄市京兆化工有限公司）、甲醇（樟树市多正化工厂）、醋酸钠（南宁市恒源化工有限公司）、三乙胺（福建省福州市汇丰化工有限公司）、磷酸二氢钠（石家庄市京兆化工有限公司）、四氢呋喃（南宁市恒源化工有限公司）、溴化四丁基铵（南宁市恒源化工有限公司）、磷酸（滕州中正化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件
依据查阅文献及考查的结果[1-10]，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为在0-10分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=20：80到乙腈-0.05%磷酸=20：80，在11-18分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=20：80到乙腈-0.05%磷酸=25：75，在18-23分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=25：75到乙腈-0.05%磷酸=20：80，在23-30分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=20：80到乙腈-0.05%磷酸=20：80；检测波长为237nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按甘草酸峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取复方桔梗止咳片适量，精密量取，置50mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声处理十分钟使溶解，放置至室温，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取甘草酸和甘草苷对照品2mg、20mg，置100mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4 标准曲线的制备
制备浓度为10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1、25μg·mL-1、30μg·mL-1、35μg·mL-1、40μg·mL-1的甘草苷对照品溶液，制备浓度为100μg·mL-1、150μg·mL-1、200μg·mL-1、250μg·mL-1、300μg·mL-1、350μg·mL-1、400μg·mL-1的甘草酸对照品溶液。分别按甘草苷、甘草酸的测定参数继续测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，甘草苷在10～40μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；甘草酸在100～400μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，分别精密吸取甘草苷和甘草酸对照品溶液重复测定6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.66%和0.79%。结果表明，本实验精密度良好。
2.6 重现性试验
分别称取同批复方桔梗止咳片样品6份，分别依照2.3项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值，RSD值为0.75%，0.79%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.7 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8h进样测定，供试品甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.77%和0.81%。结果表明甘草苷和甘草酸至少在8h內稳定。
2.8 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，分精密添加一定量的甘草苷和甘草酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。6次测定的平均回收率分别为99.5%和99.8%，RSD分别为0.69%和0.65%。 2.9 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方桔梗止咳片三批样品中甘草苷和甘草酸的含量，结果三批样品的甘草苷和甘草酸含量分别为132μg·片-1、125μg·片-1、131μg·片-1和421μg·片-1、412μg·片-1、422μg·片-1。
3 讨论
分别考察甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（30：20：50），乙腈-1.0%醋酸溶液（32∶68），甲醇-乙腈-水（40：30：30），甲醇-0.2%磷酸水（60∶40） 甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.0）（30：15：55），甲醇-乙腈-水（40：40：20），乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱，结果以乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱为流动相。
参考文献
[1]卓越，王新春，甘永祥，张华，边海旭，陈文.高效液相色谱法测定甘草中4种黄酮类化合物[J].中成药，2010（4）.
[2]刘晓娜，高彦华，乔喜芹，李强，范玉玲.复方甘草片中甘草酸、异甘草苷、异甘草素的测定[J].黑龙江医药，2006（1）.
[3]童德军，刘红.高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸含量的研究[J].时珍国医国药，2008（10）.
[4]段天璇，于密密，刘春生，马长华，王文全，魏勝利.HPLC法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量[J].中成药，2006（2）.
[5]宋丽军，谭晓梅，罗佳波.HPLC法同时测定甘草中甘草苷、甘草酸、甘草次酸含量[J].中药材，2009（3）.
[6]毕鸿亮，苏流坤，黄文艺，孙翠香，胡英杰.RP-HPLC法测定复方中药制剂中的甘草酸含量[A]，十五次全国色谱学术报告会文集（下册）[C]，2005.
[7]刘扬，杨峻山.高效液相色谱法对中药复方四君子汤中异甘草素、甘草素、异甘草苷和甘草苷的含量测定（英文）[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2005（4）.
[8]何素珍，张忠义，张守尧.油包水型微乳液相色谱法测定甘草中甘草酸含量[A].共铸医药学术新文明——2012年广东省药师周大会论文集[C]，2012.
[9]王丽琼.反相高效液相色谱法测定甘草浸膏中甘草酸和甘草苷含量[J].中国药业，2009（17）.
[10]崔淑芬，张信青，许柏球，王小如.高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷的含量[J].时珍国医国药，2006（3）.
关键词：复方桔梗止咳片；甘草苷；甘草酸
复方桔梗止咳片由桔梗、远志（蜜炙）、款冬花（蜜炙）、甘草等组成。复方桔梗止咳片为黄褐色片；气微香，味甘、微涩，具有镇咳、祛痰的功效。甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的作用。《药性论》记载"：主腹中冷痛，治惊痫，除腹胀满；补益五脏；制诸药毒；养肾气内伤，令人阴（不）痿；主妇人血沥腰痛；虚而多热；加而用之。"甘草常用于脾胃虚弱、，心悸气短、咳嗽痰多、痈肿疮毒、缓解药物毒性等。甘草含有甘草甜素（glycyrrhizin）、甘草酸（glycyrrhinic acid）、甘草次酸（glycyrrhetic acid，glycyrrhetinic acid）、异甘草黄甙（iso-liquiritin）、甘草西定（licoricidin）、甘草醇（glycyrol）、5-0-甲基甘草醇（5-0-methyl glycerol）、异甘草醇（iso-glycyrol）等成分。本文采用高校液相测定了复方桔梗止咳片中甘草酸和甘草苷的含量。
1 仪器与试药
EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司）； HH-601超级恒温水浴（江苏金坛市亿通电子有限公司）；320 XT 电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）。
TBL10-250C双频加热型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；Histoon Lab I-05实验室超纯水器（科尔顿（中国）有限公司）；TΜ-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。甘草苷和甘草酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（石家庄市京兆化工有限公司）、甲醇（樟树市多正化工厂）、醋酸钠（南宁市恒源化工有限公司）、三乙胺（福建省福州市汇丰化工有限公司）、磷酸二氢钠（石家庄市京兆化工有限公司）、四氢呋喃（南宁市恒源化工有限公司）、溴化四丁基铵（南宁市恒源化工有限公司）、磷酸（滕州中正化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件
依据查阅文献及考查的结果[1-10]，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为在0-10分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=20：80到乙腈-0.05%磷酸=20：80，在11-18分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=20：80到乙腈-0.05%磷酸=25：75，在18-23分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=25：75到乙腈-0.05%磷酸=20：80，在23-30分钟内流动相配比从乙腈-0.05%磷酸=20：80到乙腈-0.05%磷酸=20：80；检测波长为237nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按甘草酸峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取复方桔梗止咳片适量，精密量取，置50mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声处理十分钟使溶解，放置至室温，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取甘草酸和甘草苷对照品2mg、20mg，置100mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4 标准曲线的制备
制备浓度为10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1、25μg·mL-1、30μg·mL-1、35μg·mL-1、40μg·mL-1的甘草苷对照品溶液，制备浓度为100μg·mL-1、150μg·mL-1、200μg·mL-1、250μg·mL-1、300μg·mL-1、350μg·mL-1、400μg·mL-1的甘草酸对照品溶液。分别按甘草苷、甘草酸的测定参数继续测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，甘草苷在10～40μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；甘草酸在100～400μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
依照2.3项下制备对照品溶液，分别精密吸取甘草苷和甘草酸对照品溶液重复测定6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD分别为0.66%和0.79%。结果表明，本实验精密度良好。
2.6 重现性试验
分别称取同批复方桔梗止咳片样品6份，分别依照2.3项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值，RSD值为0.75%，0.79%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.7 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8h进样测定，供试品甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.77%和0.81%。结果表明甘草苷和甘草酸至少在8h內稳定。
2.8 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，分精密添加一定量的甘草苷和甘草酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。6次测定的平均回收率分别为99.5%和99.8%，RSD分别为0.69%和0.65%。 2.9 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方桔梗止咳片三批样品中甘草苷和甘草酸的含量，结果三批样品的甘草苷和甘草酸含量分别为132μg·片-1、125μg·片-1、131μg·片-1和421μg·片-1、412μg·片-1、422μg·片-1。
3 讨论
分别考察甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（30：20：50），乙腈-1.0%醋酸溶液（32∶68），甲醇-乙腈-水（40：30：30），甲醇-0.2%磷酸水（60∶40） 甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.0）（30：15：55），甲醇-乙腈-水（40：40：20），乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱，结果以乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱为流动相。
参考文献
[1]卓越，王新春，甘永祥，张华，边海旭，陈文.高效液相色谱法测定甘草中4种黄酮类化合物[J].中成药，2010（4）.
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[3]童德军，刘红.高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸含量的研究[J].时珍国医国药，2008（10）.
[4]段天璇，于密密，刘春生，马长华，王文全，魏勝利.HPLC法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量[J].中成药，2006（2）.
[5]宋丽军，谭晓梅，罗佳波.HPLC法同时测定甘草中甘草苷、甘草酸、甘草次酸含量[J].中药材，2009（3）.
[6]毕鸿亮，苏流坤，黄文艺，孙翠香，胡英杰.RP-HPLC法测定复方中药制剂中的甘草酸含量[A]，十五次全国色谱学术报告会文集（下册）[C]，2005.
[7]刘扬，杨峻山.高效液相色谱法对中药复方四君子汤中异甘草素、甘草素、异甘草苷和甘草苷的含量测定（英文）[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2005（4）.
[8]何素珍，张忠义，张守尧.油包水型微乳液相色谱法测定甘草中甘草酸含量[A].共铸医药学术新文明——2012年广东省药师周大会论文集[C]，2012.
[9]王丽琼.反相高效液相色谱法测定甘草浸膏中甘草酸和甘草苷含量[J].中国药业，2009（17）.
[10]崔淑芬，张信青，许柏球，王小如.高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷的含量[J].时珍国医国药，2006（3）.