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[摘要]目的：观察牙胚发育不同时期串珠素(Perlecan)的分布与表达情况，探讨其与牙胚发育的关系。方法：出生0天、1天、1周、2周的SD大鼠取下颌第一磨牙，行Perlecan免疫组化染色(SABC法)，光镜观察其表达与分布情况。结果：Perlecan在大鼠各时间段牙胚均有阳性表达，但各时期的分布模式不同，出生后各时间段，成釉器中均为强阳性表达，而牙囊中Perlecan表达随着牙胚发育而不断增强，之后又随着牙胚的成熟而下降。结论：Perlecan可能在牙胚的发育过程中发挥着重要的调节作用。
[关键词]串珠素；牙囊；免疫组化；牙胚
[中图分类号]R781 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0305－02
牙齿的发育是一个复杂的过程，其间要经过牙胚的发生、形态形成、特异细胞的分化、特异组织的形成和成熟、牙齿的萌出等过程。串珠素是细胞外基质中的主要蛋白聚糖之一，由核心蛋白和4条硫酸肝素(heperin sulfate，HS)侧链组成，分子量约为700kD。其可以作为一种稳定基质结构和细胞—基质相互作用的粘合剂，并能介导生长因子信号对细胞增殖和分化起作用。研究表明，串珠素基因在心血管和软骨的发育过程中起着非常重要的作用。近年来，随着牙齿组织工程技术的不断发展，牙胚的发育机制已受到国内外众多学科学者的关注。本文通过观察Perlecan在牙胚发育不同时期的表达，为探讨其在牙胚发育过程中的相关机制提供实验理论依据。
1 材料和方法
1．1 标本来源：SD大鼠，一级，40只，出生0天、1天、1周、2周各10只，由第四军医大学实验动物中心提供，编号SCXK(军)2002－005，雌雄各半。
1．2 主要试剂及仪器：Olympus显微镜，Perlecan单克隆抗体为大鼠IgG(美国CHEMICOM公司)，兔抗大鼠IgG及SABC免疫组化试剂盒、DAB显色剂(北京中山生物技术公司)。
1．3 实验方法(标本制备)：用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后，分别把出生0天、1天、1周，2周各时间段大鼠的下颌第一磨牙连同下颌骨一起取下，在40g/L多聚甲醛液中固定24h。用8mol/L甲酸和1mol/L甲酸钠等量混合的脱钙液中脱钙1周，期间每天换一次脱钙液。然后流水冲24h，常规脱水、透明、浸蜡包埋，石蜡切片机制作矢状、4μm厚石蜡切片。
1．4 实验步骤：将石蜡切片分别放在梯度酒精中脱蜡至水。新鲜配置的3％双氧水室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水冲洗3次，每次2min。修复抗原：将切片侵入0.01ml，ph6.0的柠檬酸盐缓冲液中，微波炉加热，经沸腾—冷却—沸腾—冷却这样循环2次。蒸馏水冲洗3次，每次2min。滴加一抗大鼠IgO，4℃过夜。0.01MPBS洗3次，每次5min。滴加二抗(羊抗鼠IgG)，室温下放3h，0.01MPBS洗3次，每次5min。显色。替代对照，免疫前的正常血清替代一抗，空白对照，PBS代替一抗。阳性染色为棕黄色。
2 结果
出生后0天，成釉器与牙乳头间的基底膜、内釉和外釉上皮呈强阳性表达，牙囊组织有阳性信号，牙乳头为弱阳性。出生1天，成釉器进一步发育，釉结节开始形成，釉结节上皮细胞、基底膜强阳性表达，外釉、内釉、牙囊、牙乳头均有阳性表达。出生1周，内釉上皮细胞开始分化成成釉细胞，牙本质细胞尚未形成，内釉、外釉上皮强阳性表达，牙囊、牙乳头呈阳性表达。出生后2周，釉基质、牙本质已形成，牙本质表面可见斑点状的釉质形成，外釉上皮细胞、星网层已失去其独立性，所形成的多层细胞层与成釉细胞紧密相连；牙釉质成强阳性表达，牙乳头、外周上皮细胞层呈阳性表达；而上述阳性表达区主要分布在细胞周围的基质中。
3 讨论
perlecan作为一种稳定基质结构和细胞一基质相互作用的粘合剂，并能介导生长因子信号对细胞增生和分化的作用。用重组蛋白方法证实了Perlecan功能区V上的HS侧链带有负电，通过其吸水性增加组织的容积，可以结合、释放生长因子，使生长因子暂时失活，并在必要时恢复其活性，具有生长因子储存库的作用，并且是细胞粘附分子的重要配体。大量体外研究显示perlecan作为一种重要的细胞外基质蛋白在机体心血管和软骨发育、血管生成与功能调控等多种生命过程中均具有重要作用，提示其在发育过程中发挥着广泛的作用。近年来的研究发现，Perlecan不仅决定细胞形态，还控制细胞的生长、分化、调节细胞受体及基因表达。在我们的实验中发现，出生后各时间组中牙胚中perlecan有程度不一的阳性表达，说明Perlecan在牙胚发育过程中起着非常重要的作用，其对牙胚发育不仅是起着对牙胚中各种细胞的粘附、扩散及移行的作用，而且，影响着它们的生长与分化。
在牙胚发育过程中，上皮－间充质起着诱导和调控作用，调控着牙胚的发育和细胞分化，其作用是通过细胞间产生的信号分子作用来实现的。在牙胚发育过程中，成釉器和牙乳头间存在一层基底膜，基底膜可对前成牙本质细胞器诱导作用，而细胞外基质成分作为一种分子信号控制着细胞的分化。本实验中观察到自出生0天起，牙囊、成釉细胞一直是强阳性表达，而基底膜一直呈阳性表达。因而推测Perlecan通过控制牙囊、牙本质细胞、成釉细胞的分化，来影响间充质细胞间的相互诱导作用，并通过基底膜成分的介导，从而参与成釉器、牙本质的分化与成熟。
Perlecan在发育中的必须作用目前尚不知道。但最新发现Perlecan可以结合成纤维细胞生长因子(fibroblaast geowth factor，FGF)和生长因子结合蛋白。从而提示Perlecan在大鼠牙胚的发育过程中的作用，还可能与介导FGF等生长因子有关。
Perlecan作为一种重要的细胞外基质蛋白，与机体多种器官的发育密切相关。本实验仅提供了Perlecan在牙胚的发育过程中的时空表达，说明其与牙胚的发育主要起这调节和介导作用，而Perlecan在牙胚发育过程中更详细的机制还有待于进一步实验证明。
[关键词]串珠素；牙囊；免疫组化；牙胚
[中图分类号]R781 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)03－0305－02
牙齿的发育是一个复杂的过程，其间要经过牙胚的发生、形态形成、特异细胞的分化、特异组织的形成和成熟、牙齿的萌出等过程。串珠素是细胞外基质中的主要蛋白聚糖之一，由核心蛋白和4条硫酸肝素(heperin sulfate，HS)侧链组成，分子量约为700kD。其可以作为一种稳定基质结构和细胞—基质相互作用的粘合剂，并能介导生长因子信号对细胞增殖和分化起作用。研究表明，串珠素基因在心血管和软骨的发育过程中起着非常重要的作用。近年来，随着牙齿组织工程技术的不断发展，牙胚的发育机制已受到国内外众多学科学者的关注。本文通过观察Perlecan在牙胚发育不同时期的表达，为探讨其在牙胚发育过程中的相关机制提供实验理论依据。
1 材料和方法
1．1 标本来源：SD大鼠，一级，40只，出生0天、1天、1周、2周各10只，由第四军医大学实验动物中心提供，编号SCXK(军)2002－005，雌雄各半。
1．2 主要试剂及仪器：Olympus显微镜，Perlecan单克隆抗体为大鼠IgG(美国CHEMICOM公司)，兔抗大鼠IgG及SABC免疫组化试剂盒、DAB显色剂(北京中山生物技术公司)。
1．3 实验方法(标本制备)：用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后，分别把出生0天、1天、1周，2周各时间段大鼠的下颌第一磨牙连同下颌骨一起取下，在40g/L多聚甲醛液中固定24h。用8mol/L甲酸和1mol/L甲酸钠等量混合的脱钙液中脱钙1周，期间每天换一次脱钙液。然后流水冲24h，常规脱水、透明、浸蜡包埋，石蜡切片机制作矢状、4μm厚石蜡切片。
1．4 实验步骤：将石蜡切片分别放在梯度酒精中脱蜡至水。新鲜配置的3％双氧水室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水冲洗3次，每次2min。修复抗原：将切片侵入0.01ml，ph6.0的柠檬酸盐缓冲液中，微波炉加热，经沸腾—冷却—沸腾—冷却这样循环2次。蒸馏水冲洗3次，每次2min。滴加一抗大鼠IgO，4℃过夜。0.01MPBS洗3次，每次5min。滴加二抗(羊抗鼠IgG)，室温下放3h，0.01MPBS洗3次，每次5min。显色。替代对照，免疫前的正常血清替代一抗，空白对照，PBS代替一抗。阳性染色为棕黄色。
2 结果
出生后0天，成釉器与牙乳头间的基底膜、内釉和外釉上皮呈强阳性表达，牙囊组织有阳性信号，牙乳头为弱阳性。出生1天，成釉器进一步发育，釉结节开始形成，釉结节上皮细胞、基底膜强阳性表达，外釉、内釉、牙囊、牙乳头均有阳性表达。出生1周，内釉上皮细胞开始分化成成釉细胞，牙本质细胞尚未形成，内釉、外釉上皮强阳性表达，牙囊、牙乳头呈阳性表达。出生后2周，釉基质、牙本质已形成，牙本质表面可见斑点状的釉质形成，外釉上皮细胞、星网层已失去其独立性，所形成的多层细胞层与成釉细胞紧密相连；牙釉质成强阳性表达，牙乳头、外周上皮细胞层呈阳性表达；而上述阳性表达区主要分布在细胞周围的基质中。
3 讨论
perlecan作为一种稳定基质结构和细胞一基质相互作用的粘合剂，并能介导生长因子信号对细胞增生和分化的作用。用重组蛋白方法证实了Perlecan功能区V上的HS侧链带有负电，通过其吸水性增加组织的容积，可以结合、释放生长因子，使生长因子暂时失活，并在必要时恢复其活性，具有生长因子储存库的作用，并且是细胞粘附分子的重要配体。大量体外研究显示perlecan作为一种重要的细胞外基质蛋白在机体心血管和软骨发育、血管生成与功能调控等多种生命过程中均具有重要作用，提示其在发育过程中发挥着广泛的作用。近年来的研究发现，Perlecan不仅决定细胞形态，还控制细胞的生长、分化、调节细胞受体及基因表达。在我们的实验中发现，出生后各时间组中牙胚中perlecan有程度不一的阳性表达，说明Perlecan在牙胚发育过程中起着非常重要的作用，其对牙胚发育不仅是起着对牙胚中各种细胞的粘附、扩散及移行的作用，而且，影响着它们的生长与分化。
在牙胚发育过程中，上皮－间充质起着诱导和调控作用，调控着牙胚的发育和细胞分化，其作用是通过细胞间产生的信号分子作用来实现的。在牙胚发育过程中，成釉器和牙乳头间存在一层基底膜，基底膜可对前成牙本质细胞器诱导作用，而细胞外基质成分作为一种分子信号控制着细胞的分化。本实验中观察到自出生0天起，牙囊、成釉细胞一直是强阳性表达，而基底膜一直呈阳性表达。因而推测Perlecan通过控制牙囊、牙本质细胞、成釉细胞的分化，来影响间充质细胞间的相互诱导作用，并通过基底膜成分的介导，从而参与成釉器、牙本质的分化与成熟。
Perlecan在发育中的必须作用目前尚不知道。但最新发现Perlecan可以结合成纤维细胞生长因子(fibroblaast geowth factor，FGF)和生长因子结合蛋白。从而提示Perlecan在大鼠牙胚的发育过程中的作用，还可能与介导FGF等生长因子有关。
Perlecan作为一种重要的细胞外基质蛋白，与机体多种器官的发育密切相关。本实验仅提供了Perlecan在牙胚的发育过程中的时空表达，说明其与牙胚的发育主要起这调节和介导作用，而Perlecan在牙胚发育过程中更详细的机制还有待于进一步实验证明。