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【摘要】：微生物降解是解决抗生素污染的有效途径，主要是通过微生物的降解作用，将环境中的抗生素残留分解成水和二氧化碳，达到弱化其生态毒性的目的。筛选能够以四环素类抗生素为碳源的降解菌株，并对其进行16S rDNA鉴定，为今后深入研究四环素类抗生素降解菌的降解效果及影响因素奠定基础。
【关键词】：微生物降解；筛选；降解菌株；鉴定
Abstract： Microbial degradation is an effective way to solve the problem of antibiotic pollution.The main purpose is to decompose the antibiotic residues in the environment into water and carbon dioxide through the degradation of microorganisms， so as to weaken the ecotoxicity. The tetracycline antibiotic-degrading strain was screened and its 16S rDNA was identified， which lays the foundation for further studies on the degradation and influencing factors of tetracycline antibiotic-degrading bacteria in the future.
Key words： microbial degradation； screening； degrading strains； identification
介绍
近年来，随着我国养殖业的发展，四环素类抗生素因其价格低廉、效果显著等优点被广泛使用。但由于该类抗生素在动物体内的吸收率较低，绝大部分会随着动物排泄物进入环境，并在环境中不断积累，对环境安全和人体健康构成巨大的潜在危害 [1]。
处理抗生素污染的方法有很多，主要分为非生物降解和生物降解[2]。非生物降解主要是通过物理或化学手段使抗生素降解，如光解、水解和氧化降解等。虽然非生物降解能够快速去除抗生素残留，但应用于抗生素降解的化学材料会对环境产生一定程度的毒副作用[3，4]。生物降解主要包括微生物降解、植物降解以及植物—微生物复合降解[5]，具有低耗、环保和操作简单等优点，已成为处理抗生素污染的有效途径。
微生物降解主要是通过微生物的降解作用，将抗生素从大分子物质分解成小分为物质，直至将其分解完全。因此，筛选出能够降解四环素类抗生素的菌株，是解决四环素类抗生素污染问题的关键。本实验通过筛选能够以四环素类抗生素為营养物质的菌株，并对其进行16S rDNA鉴定，初步得到四环素类抗生素降解菌，为今后深入研究四环素类抗生素的降解效果、最佳降解条件奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源
本实验样品取自北京农学院林场的土壤。取样时，土壤用无菌自封袋装好，置于-20℃冰箱中待用。
1.1.2 培养基
基础无机盐培养基：CaCl2，0.02g； （NH4）2SO4，1.0g；NaCl，0.5g；FeCl3，0.05g；K2HPO4，1.0g；NH4NO3，1.0g； KH2PO4，1.0g；pH=7.0；
微量元素溶液：CoCl2·6H2O ，2g；MnCl2·4 H2O，8.5g；ZnCl2，0.1g；NiCl2·6H2O ，0.2g；CuSO4·5H2O，0.3g；Na2MoO4·2H2O，0.2g；Na2SeO4·2H2O，0.2g定容至1L容量瓶中待用；
筛选培养基：在灭菌无机盐培养基中加入土霉素、金霉素和四环素，根据试验需要配置成不同浓度；微量元素添加量为1mL·L-1；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g ，琼脂18g，定容至1L，pH=7.2-7.4；
营养培养基：在灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中加入土霉素、金霉素和四环素，根据试验需要配置成不同的浓度。
1.2 方法
1.2.1 降解菌的筛选
取土壤样品2.0g，加入含有20 mg·L-1四环素类抗生素无机盐培养液的三角瓶中，30℃，150 r·min-1在摇床中黑暗培养7d；取0.5mL培养液，加到四环素类抗生素浓度为40 mg·L-1的筛选培养基中，30℃，150 r·min-1在摇床中黑暗培养7d。重复以上操作，直至四环素类抗生素浓度为100 mg·L-1。
1.2.2 降解菌的纯化
在四环素类抗生素浓度为100 mg·L-1的营养培养基上，用稀释涂布法和平板划线法对筛选出的菌株进行分离、纯化。
1.2.3降解菌的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[7]对得到的菌株进行形态观察。由上海美吉生物医药科技有限公司对降解菌株进行16S rDNA鉴定。
2 结果与分析
2.1 降解菌的筛选纯化及其形态特征
经过筛选和纯化，得到1株能够以四环素类抗生素为营养来源的降解菌株，该菌在营养培养基平板上生长良好，菌落呈圆形，轻微隆起，湿润，半透明，边缘整齐、光滑（图1）。根据其形态特征初步判定该菌为细菌。
2.2 降解菌的鉴定
首先对菌株进行基因组DNA抽提、电泳检测及PCR扩增等处理，然后切胶纯化测序并拼接序列，最后在NCBI进行序列比对，找到相似度最高的菌株序列（图2）。根据菌株的形态特征和比对结果初步鉴定该菌为无色杆菌。
讨论
通过向无碳源的无机盐培养液中添加四环素类抗生素，来驯化、筛选能够分解利用抗生素进行正常生命活动的菌株，达到降解的目的。虽然筛选得到的菌株能够在含有高浓度四环素类抗生素的无机盐溶液中正常生长，但其降解效果尚不明确。今后，将对所得菌株的降解效果进行深入研究，并探究其对不同浓度抗生素的降解效果。
四环素类抗生素的稳定性以及微生物的生长受温度、pH等因素的影响，因此有必要研究不同因素对降解菌降解效果的影响，找到最佳降解条件，从而得到能够同时降解多种四环素类抗生素的高效菌株。
【参考文献】：
[1]杨晓洪，王娜，叶波平.畜禽养殖中的抗生素残留以及耐药菌和抗性基因研究进展[J].药物生物技术，2014，21（6）：583-588.
[2]李伟明，明摇，鲍艳宇.四环素类抗生素降解途径及其主要降解产物研究进展[J].应用生态学报，2012，23（8）：2300-2308.
[3]贺德春，许振成，吴根义，等.四环素类抗生素的环境行为研究进展[J].动物医学进展，2011，32（4）：98-102.
[4] CABELLO E C. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture： a growing problem for human and for the environment [J]. Environmental Microbiology， 2006，8：1137-1144.
[5]刘伟，王慧，陈小军，等.抗生素在环境中降解的研究进展[J].动物医学进展，2009，30（3）：89-94.
[6]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[7]Buchanan RE， Gibbons NE. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition[M]. USA，1994，The Williams&Wilkins Company.
【关键词】：微生物降解；筛选；降解菌株；鉴定
Abstract： Microbial degradation is an effective way to solve the problem of antibiotic pollution.The main purpose is to decompose the antibiotic residues in the environment into water and carbon dioxide through the degradation of microorganisms， so as to weaken the ecotoxicity. The tetracycline antibiotic-degrading strain was screened and its 16S rDNA was identified， which lays the foundation for further studies on the degradation and influencing factors of tetracycline antibiotic-degrading bacteria in the future.
Key words： microbial degradation； screening； degrading strains； identification
介绍
近年来，随着我国养殖业的发展，四环素类抗生素因其价格低廉、效果显著等优点被广泛使用。但由于该类抗生素在动物体内的吸收率较低，绝大部分会随着动物排泄物进入环境，并在环境中不断积累，对环境安全和人体健康构成巨大的潜在危害 [1]。
处理抗生素污染的方法有很多，主要分为非生物降解和生物降解[2]。非生物降解主要是通过物理或化学手段使抗生素降解，如光解、水解和氧化降解等。虽然非生物降解能够快速去除抗生素残留，但应用于抗生素降解的化学材料会对环境产生一定程度的毒副作用[3，4]。生物降解主要包括微生物降解、植物降解以及植物—微生物复合降解[5]，具有低耗、环保和操作简单等优点，已成为处理抗生素污染的有效途径。
微生物降解主要是通过微生物的降解作用，将抗生素从大分子物质分解成小分为物质，直至将其分解完全。因此，筛选出能够降解四环素类抗生素的菌株，是解决四环素类抗生素污染问题的关键。本实验通过筛选能够以四环素类抗生素為营养物质的菌株，并对其进行16S rDNA鉴定，初步得到四环素类抗生素降解菌，为今后深入研究四环素类抗生素的降解效果、最佳降解条件奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源
本实验样品取自北京农学院林场的土壤。取样时，土壤用无菌自封袋装好，置于-20℃冰箱中待用。
1.1.2 培养基
基础无机盐培养基：CaCl2，0.02g； （NH4）2SO4，1.0g；NaCl，0.5g；FeCl3，0.05g；K2HPO4，1.0g；NH4NO3，1.0g； KH2PO4，1.0g；pH=7.0；
微量元素溶液：CoCl2·6H2O ，2g；MnCl2·4 H2O，8.5g；ZnCl2，0.1g；NiCl2·6H2O ，0.2g；CuSO4·5H2O，0.3g；Na2MoO4·2H2O，0.2g；Na2SeO4·2H2O，0.2g定容至1L容量瓶中待用；
筛选培养基：在灭菌无机盐培养基中加入土霉素、金霉素和四环素，根据试验需要配置成不同浓度；微量元素添加量为1mL·L-1；
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g ，琼脂18g，定容至1L，pH=7.2-7.4；
营养培养基：在灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中加入土霉素、金霉素和四环素，根据试验需要配置成不同的浓度。
1.2 方法
1.2.1 降解菌的筛选
取土壤样品2.0g，加入含有20 mg·L-1四环素类抗生素无机盐培养液的三角瓶中，30℃，150 r·min-1在摇床中黑暗培养7d；取0.5mL培养液，加到四环素类抗生素浓度为40 mg·L-1的筛选培养基中，30℃，150 r·min-1在摇床中黑暗培养7d。重复以上操作，直至四环素类抗生素浓度为100 mg·L-1。
1.2.2 降解菌的纯化
在四环素类抗生素浓度为100 mg·L-1的营养培养基上，用稀释涂布法和平板划线法对筛选出的菌株进行分离、纯化。
1.2.3降解菌的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[7]对得到的菌株进行形态观察。由上海美吉生物医药科技有限公司对降解菌株进行16S rDNA鉴定。
2 结果与分析
2.1 降解菌的筛选纯化及其形态特征
经过筛选和纯化，得到1株能够以四环素类抗生素为营养来源的降解菌株，该菌在营养培养基平板上生长良好，菌落呈圆形，轻微隆起，湿润，半透明，边缘整齐、光滑（图1）。根据其形态特征初步判定该菌为细菌。
2.2 降解菌的鉴定
首先对菌株进行基因组DNA抽提、电泳检测及PCR扩增等处理，然后切胶纯化测序并拼接序列，最后在NCBI进行序列比对，找到相似度最高的菌株序列（图2）。根据菌株的形态特征和比对结果初步鉴定该菌为无色杆菌。
讨论
通过向无碳源的无机盐培养液中添加四环素类抗生素，来驯化、筛选能够分解利用抗生素进行正常生命活动的菌株，达到降解的目的。虽然筛选得到的菌株能够在含有高浓度四环素类抗生素的无机盐溶液中正常生长，但其降解效果尚不明确。今后，将对所得菌株的降解效果进行深入研究，并探究其对不同浓度抗生素的降解效果。
四环素类抗生素的稳定性以及微生物的生长受温度、pH等因素的影响，因此有必要研究不同因素对降解菌降解效果的影响，找到最佳降解条件，从而得到能够同时降解多种四环素类抗生素的高效菌株。
【参考文献】：
[1]杨晓洪，王娜，叶波平.畜禽养殖中的抗生素残留以及耐药菌和抗性基因研究进展[J].药物生物技术，2014，21（6）：583-588.
[2]李伟明，明摇，鲍艳宇.四环素类抗生素降解途径及其主要降解产物研究进展[J].应用生态学报，2012，23（8）：2300-2308.
[3]贺德春，许振成，吴根义，等.四环素类抗生素的环境行为研究进展[J].动物医学进展，2011，32（4）：98-102.
[4] CABELLO E C. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture： a growing problem for human and for the environment [J]. Environmental Microbiology， 2006，8：1137-1144.
[5]刘伟，王慧，陈小军，等.抗生素在环境中降解的研究进展[J].动物医学进展，2009，30（3）：89-94.
[6]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[7]Buchanan RE， Gibbons NE. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition[M]. USA，1994，The Williams&Wilkins Company.