探讨下调let-7微小RNA(miRNA)的表达对卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解复制的影响。
方法采用miRNA海绵技术抑制let-7 miRNAs的表达,脂质体法将pEGFP-C2-let-7 sponge质粒转染到BCBL-1和293T细胞中。实时荧光定量PCR法检测let-7 miRNAs的表达,丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)、环氧合酶2(COX-2)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)mRNA的表达以及KSHV开放读码框(ORF)50和ORF72基因DNA复制水平。Western blot法检测MAP4K4和COX-2蛋白的表达以及p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的表达及磷酸化水平。
结果在BCBL-1细胞中,let-7 sponge组中let-7 miRNAs的相对表达水平与空载体组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);在293T细胞中,let-7 sponge组中let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和let-7i的相对表达水平与空载体组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。质粒转染BCBL-1细胞48 h后,空载体组和let-7 sponge组中KSHV ORF50 DNA的相对复制水平分别为1.00±0.10和2.33±0.18,差异有统计学意义(P<0.001); KSHV ORF50 mRNA的相对表达水平分别为1.08±0.48和3.22±0.27,差异有统计学意义(P<0.001)。空载体组和let-7 sponge组中KSHV ORF72 DNA的相对复制水平分别为1.07±0.49和1.67±0.45,mRNA相对表达水平分别为1.01±0.19和1.54±0.11,差异均有统计学意义(均P<0.05)。转染质粒48 h后,空载体组和let-7 sponge组中MAP4K4 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和5.73±0.96,COX-2 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和2.68±0.19,MMP-13 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.02和2.69±0.25,差异均有统计学意义(均P<0.001)。let-7 sponge组与空载体组比较,MAP4K4和COX-2的蛋白表达水平也明显提高。在BCBL-1细胞中let-7 miRNAs的表达下调时,KSHV ORF50和ORF72 mRNA的表达水平增加,KSHV ORF50和ORF72 DNA的复制水平增加,MAP4K4、COX-2和MMP-13 mRNA的表达上调。在293T和BCBL-1细胞中,let-7 sponge组的ERK1/2磷酸化水平高于空载体组,但p38和JNK磷酸化水平无变化。
结论抑制细胞let-7 miRNAs的表达可激活KSHV复制,其可能是通过上调其靶基因MAP4K4的表达,上调MAP4K4下游因子COX-2和MMP-13的表达水平及ERK1/2磷酸化水平来诱发KSHV的激活,最终导致卡波西肉瘤的发生和发展。