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摘 要：目的：建立并优化泽泻反应体系和扩增程序，筛选出多态性、重复性较好的ISSR引物，为泽泻种源鉴别以及指纹图谱的构建提供理论基础。方法：利用单因素试验法，对Mg2+浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度及模板DNA含量这5个PCR反应体系主要成分以及退火温度进行筛选，并利用建立优化的反应体系和扩增程序对以往泽泻文献报道的ISSR引物进行筛选。结果：建立了最佳PCR反应体系：20μL的反应液中含2.0mmol·L-1Mg2+，0.4mmol·L-1dNTPs，1.0 U TaqDNA聚合酶，0.4mol·L-1引物，10ng模板DNA，2μL 10xBuffer，13.1 μL dd H2O。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s。58.9℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。结论：利用优化的泽泻的反应体系，筛选出15条多态性较好的引物，并对泽泻的21个种源进行ISSR扩增，扩增出的条带清晰、多态性较高，证实了该体系具有较高稳定性、重现性和适用性。此体系也为泽泻种源间的遗传多样性研究以及ISSR分子标记奠定了基础。
关键词：泽泻；ISSR；反应体系；优化
中图分类号 R282.7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）07-0023-05
Abstract：Objectives：To establish optimized ISSR system of Alisma orientale（Samuel）Juz for selection of ISSR primers with high stability and repeatability. Methods：Applied the single factor design for optimizing five factors on ISSR amplification，such as Mg2+ concentration，dNTPs concentration，TaqDNA polymerase concentration，primer concentration and template DNA concentration.Results：The results showed that the optimal 20μL ISSR-PCR reaction system for Alisma orientale（Samuel）Juz contained 2.0mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，1.0 U TaqDNA polymerase，0.4mol/L primer，10ng DNA template，2μL 10xBuffer，13.1 μL ddH2O.On this optimal ISSR amplification system，15 primers were screened with good polymorphism baased on previous achievement on Alisma orientale（Samuel）Juz primers.Conclusion：15 primers with high polymorphism were effectively selected based on the optimized ISSR system.The test showed that the system was stable ，reliable and applicative. The optimal ISSR-PCR reaction system is suitable for the study of genetic diversity in plant of Alisma orientale（Samuel）Juz in different provenances.
Key words：Alisma orientale（Samuel）Juz；ISSR；Reaction system；Optimize
澤泻[Alisma orientale（Samuel）Juz]为泽泻科植物，在我国主要分布在福建、四川、江西等省区，生长在海拔几十米至2 500m左右的湖泊、水塘、沟渠、沼泽中[1]，具有抑制动脉硬化、降血脂、利尿、降血压、抗脂肪肝等作用，为地道药材[2-3]。除了药用外，园林上也有将泽泻种植于浅水区供观赏用。目前已从包括形态解剖学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学等多个领域对中国地道药材泽泻进行了不少的分类研究[4]。国内也有不少关于泽泻类植物鉴别方面的研究，例如，胡珊梅等[5]运用了随机扩增多态RAPD技术，对不同种原的泽泻科植物泽泻进行了研究，结果表明同种异地药材所形成的不同的居群具有不同的遗传特征。贺佳等[6]运用了简单重复序列标记ISSR技术，对四川产泽泻ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选，并建立了最适反应体系。
简单重复序列标记（Inter Simper Sequence Repeat，ISSR）是一种建立于PCR反应基础上的DNA分子标记技术.近年来，ISSR已成功用于植物遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、分子生态学研究等领域[7]。本试验拟在泽泻主产区福建、四川、广西选择21个不同种源的泽泻样品为研究材料，建立并筛选出关于泽泻的最适ISSR-PCR反应体系，在此基础上筛选出高多态性、重复性引物，为深入研究泽泻的种质资源居群差异及良种选育研究提供理论支持，也为泽泻资源的可持续开发与利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料 试验所用材料泽泻采集于广西、四川、广西、福建和江西，尽量选取嫩幼、新鲜的叶片，用硅胶干燥保存，并尽快转移至-80℃冰箱，以备DNA的提取。 1.2 主要试剂与仪器 所用TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10xPCR Buffer、6xloading Buffer均购上海生物工程技术服务有限公司；琼脂糖、核酸染料均购自北京赛西盛公司。引物参以往泽泻文献报道的ISSR引物，由上海生工合成。
1.3 试验方法
1.3.1 DNA的提取与检测 采用博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取的方法从泽泻叶片上提取DNA，取2μLDNA样品，加7μL双蒸水，于1%的琼脂糖凝胶上电泳，电压100V，时间30min。紫外摄相仪观察并摄相，看是否有一条完整清晰的DNA条带，如出现多条带或严重的拖尾，则表明DNA降解或断裂，需要重新提取。最后用紫外分光光度计检测其浓度、纯度。
1.3.2 ISSR-PCR反应体系试验设计 经过试验初步筛选，选用引物UBC811对泽泻反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度以及模板DNA含量逐一做单因素多水平梯度试验，各因素水平见表1。
1.3.3 ISSR-PCR原初体系和扩增程序的建立 参考有关泽泻ISSR分析文献[6]，设定的原初扩增程序为：反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s。56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。原初扩增反应体系为l0×Buffer 2μL；dNTPs：10mmol·L-1 0.4μL；引物：10μmol·L-1 0.8μL；MgCl2：25mmol·L-1 2.0μL；模板DNA：10ng·μL-12μL，TaqDNA聚合酶1U；灭菌ddH2O 13.6μL。
1.3.4 退火温度筛选 引物的退火温度一般下浮理论退火温度5～10℃[8]，因此设置退火温度最低为50℃，最高为60℃。PCR仪自动对退火温度生成12个梯度，筛选出最佳退火温度。
1.3.5 ISSR-PCR扩增体系的应用 利用优化的泽泻ISSR反应体系，用提取出的泽泻基因组DNA分别与备选引物进行PCR扩增，经反复筛选与比较分析，获得适用于泽泻的多态性高、重复性好、稳定性好的15条引物。并随机选取引物UBC825，对泽泻的21个种源进行DNA的扩增。
2 结果与分析
2.1 ISSR反應体系的优化
2.1.1 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响 dNTPs是ISSR反应的原料，dNTPs浓度的变化对ISSR带的数量和强弱影响较大。实验结果（图1）表明浓度在0.4mmol·L-1扩增条带较多而且比较亮，效果最佳。低于0.4mmol·L-1时，扩增条带数量逐渐减少且条带模糊，可能由于dNTPs浓度过低，Mg2+不能有效的激活TaqDNA聚合酶，合成产物的量减少；高于0.4mmol·L-1时，扩增条带扩增结果较一致。所以考虑到实验成本，dNTPs终浓度定为0.4mmol·L-1。
2.1.2 TaqDNA聚合酶对ISSR扩增的影响 TaqDNA聚合酶用量直接影响ISSR-PCR反应的成功与否，TaqDNA聚合酶在PCR中的用量受酶活性、反应体积、酶耐热性等因素的制约[9]。本试验设置了从0.25U至1.75U等7个梯度（见图2），酶用量在0.25～1.0U，随着酶用量的增加，扩增条带的数量逐渐增多且条带逐渐清晰、明亮。为了避免高浓度TaqDNA聚合酶会引起非特异性扩增[10]，确定最佳使用量为1.0U。
2.1.3 引物浓度对ISSR扩增的影响 引物浓度过高会引起碱基间的错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者又竞争使用TaqDNA聚合酶、dNTPs，这些均会使得扩增效率下降[11]。本实验中将引物浓度设置在0.1～0.7μmol·L-1，浓度呈梯度变化，不同引物浓度扩增结果见图3。本实验中当引物浓度为0.1μmol·L-1时，扩增条带较模糊。引物浓度太高，可能会导致非特异性产物的出现，而在本实验中，引物浓度为0.2～0.7μmol·L-1时，扩增的条带基本一致，比较清晰而且条带比较多，但浓度为0.5～0.7μmol·L-1时条带稍弱，综合考虑经济因素，确定最后引物浓度为0.3μmol·L-1。
2.1.4 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响 Mg2+会极大的影响TaqDNA聚合酶活性，还影响着模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物的退火和引物二聚体的形成等[12]。本实验（图4）设置了0.5～3.5mmol·L-1等7个梯度，当Mg2+浓度<1.5mmol·L-1时没有扩增出条带。当Mg2+浓度在2.0、2.5、3.0、3.5mmol·L-1L等4个浓度时，条带清晰，亮度逐渐变亮，条带逐渐减少，最终确定Mg2+浓度为2.0mmol·L-1。
2.1.5 模板DNA含量对ISSR扩增的影响 DNA模板的用量是影响PCR扩增的重要因素。实验结果表明（图5），本试验设计的7个梯度水平的DNA含量，均能扩增出清晰，明亮的条带且无明显差异。这与吴鑫等研究结果相一致[13]。考虑到DNA用量越少越好，因此本实验选择10ng模板DNA含量为ISSR-PCR反应体系的最佳含量。
2.2 退火温度的确定及有效引物筛选 退火温度取决于引物的碱基组成、长度和浓度[14]。一般来说，较低的退火温度可提高PCR反应的敏感性但可能会出现非特异性现象，而较高的退火温度则可提高PCR反应的特异性但却降低了其扩增产率。一般情况下，退火温度应下浮引物Tm值5℃左右[15]，实际实验时应根据所要求的PCR反应的特异性和灵敏度做出相应的调整。因此，优化退火温度的最理想方法是设置一系列对照反应来确定最佳退火温度。本实验设置了51.0、51.2、51.8、52.7、53.8、55.1、56.4、57.7、58.9、59.8、60.5、60.9℃12个退火温度。结果表明（见图6）：在退火温度小于55.1℃时，产物少，当温度大于60.5℃时，无扩增产物，可能是因为退火温度过高，扩增反应受到限制，产物有所减少，当温度为58.9℃时扩增产物多明显，故引物UBC811最适合的退火温度为58.9℃。 利用已优化的泽泻ISSR-PCR反应体系及扩增程序，对备选引物进行筛选（见图7），最终筛选出15条条带清晰、多态性丰富且重复性高的有效引物（表2）。
2.3 ISSR-PCR反应体系的验证 利用引物UBC825对泽泻的21个种源进行ISSR-PCR扩增，结果如图8所示，通过实验优化过的ISSR-PCR反应体系稳定性强，重复性高，扩增条带分离清晰，多态性高，特异性丰富。证明通过单因素试验建立的ISSR-PCR反应体系稳定可靠，能够应用于后续实验研究。
3 结论与讨论
ISSR分子标记技术结合了SSR、RAPD等技术的有点，具有高稳定性和重复性，同时也受到ISSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA等因素的影响[16]。
扩增体系中的影响因子对泽泻ISSR-PCR反应有着重要的影响，每一种因素的变化都有可能导致结果不同，因此确定一个理想的最优反应体系对ISSR-PCR反应是很重要的。本实验发现，dNTPs浓度降低则PCR产量降低；浓度过高容易引起碱基的错配，使产物的特异性下降，因此必须调整好dNTPs的浓度。这与Ou L J等[17]研究相一致。TaqDNA聚合酶浓度过高，容易产生非特异性条带；浓度过低，导致扩增产物产量降低。引物浓度过低，扩增反应过提早结束，扩增条带不够清晰、明亮。这与田艳伶等[18]研究相一致。Mg2+浓度过低，TaqDNA聚合酶活力下降；Mg2+过高又会增加非特异性扩增[19]。DNA含量的高低对扩增产物几乎不产生影响。
本实验采用单因素试验，利用初始程序和体系对影响ISSR-PCR反应的5个因素进行了优化，建立了泽泻ISSR的技术体系。反应终体积是20μL，含有10×Buffer2.0μL、Mg2+2.0mmol·L-1、dNTPs0.4mmol·L-1、引物0.4μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0U、模板DNA10ng、加灭菌ddH2O定容至20μL。ISSR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58.9℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；72℃延伸7min；4℃结束扩增。利用最优体系，从备选引物中筛选出15条多态性高、稳定性好以及重现性好的引物，为泽泻不同种源的遗传多样性研究和亲缘关系评价提供了技术基础。
参考文献
[1]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1992：141-142.
[2]Liu Y Q，Chen X F，Yang W Y，et al.Dynamic accumulation of chromium in Alisma orientale and its effect on growth of Alisma orientale under nitrogen-chromium coupling[J].Chinese Traditional & Herbal Drugs，2012，43（5）：978-983.
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[6]贺佳，丁小余，褚必海，等.泽泻ISSR反应体系的建立与优化[J].南京师大学报（自然科学版），2006，03：86-90.
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[15]胡甦，王永清，陶炼，等.三角紫叶酢浆草ISSR反应体系的建立与优化[J].草业学报，2011，20（5）：142-150.
[16]何正文，刘运生，陈立华，等.正交设计直观分析法优化PCR条件[J].湖南医科大学学报，1998，04：76-77.
[17]Ou L J，Yan W，Liao Y X，et al.Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system in Asparagus cochinchinensis[J].Chinese Traditional & Herbal Drugs，2011，42（2）：353-357.
[18]田艳伶，李志辉，杨模华，等.钩栗ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].中南林业科技大学学报，2015（2）：32-37.
[19]冯夏莲，何承忠，张志毅，等.毛白杨ISSR反应体系的建立及优化[J].北京林业大学学报，2006，03：61-65.
（责编：张宏民）
关键词：泽泻；ISSR；反应体系；优化
中图分类号 R282.7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）07-0023-05
Abstract：Objectives：To establish optimized ISSR system of Alisma orientale（Samuel）Juz for selection of ISSR primers with high stability and repeatability. Methods：Applied the single factor design for optimizing five factors on ISSR amplification，such as Mg2+ concentration，dNTPs concentration，TaqDNA polymerase concentration，primer concentration and template DNA concentration.Results：The results showed that the optimal 20μL ISSR-PCR reaction system for Alisma orientale（Samuel）Juz contained 2.0mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，1.0 U TaqDNA polymerase，0.4mol/L primer，10ng DNA template，2μL 10xBuffer，13.1 μL ddH2O.On this optimal ISSR amplification system，15 primers were screened with good polymorphism baased on previous achievement on Alisma orientale（Samuel）Juz primers.Conclusion：15 primers with high polymorphism were effectively selected based on the optimized ISSR system.The test showed that the system was stable ，reliable and applicative. The optimal ISSR-PCR reaction system is suitable for the study of genetic diversity in plant of Alisma orientale（Samuel）Juz in different provenances.
Key words：Alisma orientale（Samuel）Juz；ISSR；Reaction system；Optimize
澤泻[Alisma orientale（Samuel）Juz]为泽泻科植物，在我国主要分布在福建、四川、江西等省区，生长在海拔几十米至2 500m左右的湖泊、水塘、沟渠、沼泽中[1]，具有抑制动脉硬化、降血脂、利尿、降血压、抗脂肪肝等作用，为地道药材[2-3]。除了药用外，园林上也有将泽泻种植于浅水区供观赏用。目前已从包括形态解剖学、细胞生物学、遗传学、生物化学、分子生物学等多个领域对中国地道药材泽泻进行了不少的分类研究[4]。国内也有不少关于泽泻类植物鉴别方面的研究，例如，胡珊梅等[5]运用了随机扩增多态RAPD技术，对不同种原的泽泻科植物泽泻进行了研究，结果表明同种异地药材所形成的不同的居群具有不同的遗传特征。贺佳等[6]运用了简单重复序列标记ISSR技术，对四川产泽泻ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选，并建立了最适反应体系。
简单重复序列标记（Inter Simper Sequence Repeat，ISSR）是一种建立于PCR反应基础上的DNA分子标记技术.近年来，ISSR已成功用于植物遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、分子生态学研究等领域[7]。本试验拟在泽泻主产区福建、四川、广西选择21个不同种源的泽泻样品为研究材料，建立并筛选出关于泽泻的最适ISSR-PCR反应体系，在此基础上筛选出高多态性、重复性引物，为深入研究泽泻的种质资源居群差异及良种选育研究提供理论支持，也为泽泻资源的可持续开发与利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料 试验所用材料泽泻采集于广西、四川、广西、福建和江西，尽量选取嫩幼、新鲜的叶片，用硅胶干燥保存，并尽快转移至-80℃冰箱，以备DNA的提取。 1.2 主要试剂与仪器 所用TaqDNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA ladder Marker、10xPCR Buffer、6xloading Buffer均购上海生物工程技术服务有限公司；琼脂糖、核酸染料均购自北京赛西盛公司。引物参以往泽泻文献报道的ISSR引物，由上海生工合成。
1.3 试验方法
1.3.1 DNA的提取与检测 采用博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒提取的方法从泽泻叶片上提取DNA，取2μLDNA样品，加7μL双蒸水，于1%的琼脂糖凝胶上电泳，电压100V，时间30min。紫外摄相仪观察并摄相，看是否有一条完整清晰的DNA条带，如出现多条带或严重的拖尾，则表明DNA降解或断裂，需要重新提取。最后用紫外分光光度计检测其浓度、纯度。
1.3.2 ISSR-PCR反应体系试验设计 经过试验初步筛选，选用引物UBC811对泽泻反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度以及模板DNA含量逐一做单因素多水平梯度试验，各因素水平见表1。
1.3.3 ISSR-PCR原初体系和扩增程序的建立 参考有关泽泻ISSR分析文献[6]，设定的原初扩增程序为：反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s。56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。原初扩增反应体系为l0×Buffer 2μL；dNTPs：10mmol·L-1 0.4μL；引物：10μmol·L-1 0.8μL；MgCl2：25mmol·L-1 2.0μL；模板DNA：10ng·μL-12μL，TaqDNA聚合酶1U；灭菌ddH2O 13.6μL。
1.3.4 退火温度筛选 引物的退火温度一般下浮理论退火温度5～10℃[8]，因此设置退火温度最低为50℃，最高为60℃。PCR仪自动对退火温度生成12个梯度，筛选出最佳退火温度。
1.3.5 ISSR-PCR扩增体系的应用 利用优化的泽泻ISSR反应体系，用提取出的泽泻基因组DNA分别与备选引物进行PCR扩增，经反复筛选与比较分析，获得适用于泽泻的多态性高、重复性好、稳定性好的15条引物。并随机选取引物UBC825，对泽泻的21个种源进行DNA的扩增。
2 结果与分析
2.1 ISSR反應体系的优化
2.1.1 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响 dNTPs是ISSR反应的原料，dNTPs浓度的变化对ISSR带的数量和强弱影响较大。实验结果（图1）表明浓度在0.4mmol·L-1扩增条带较多而且比较亮，效果最佳。低于0.4mmol·L-1时，扩增条带数量逐渐减少且条带模糊，可能由于dNTPs浓度过低，Mg2+不能有效的激活TaqDNA聚合酶，合成产物的量减少；高于0.4mmol·L-1时，扩增条带扩增结果较一致。所以考虑到实验成本，dNTPs终浓度定为0.4mmol·L-1。
2.1.2 TaqDNA聚合酶对ISSR扩增的影响 TaqDNA聚合酶用量直接影响ISSR-PCR反应的成功与否，TaqDNA聚合酶在PCR中的用量受酶活性、反应体积、酶耐热性等因素的制约[9]。本试验设置了从0.25U至1.75U等7个梯度（见图2），酶用量在0.25～1.0U，随着酶用量的增加，扩增条带的数量逐渐增多且条带逐渐清晰、明亮。为了避免高浓度TaqDNA聚合酶会引起非特异性扩增[10]，确定最佳使用量为1.0U。
2.1.3 引物浓度对ISSR扩增的影响 引物浓度过高会引起碱基间的错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者又竞争使用TaqDNA聚合酶、dNTPs，这些均会使得扩增效率下降[11]。本实验中将引物浓度设置在0.1～0.7μmol·L-1，浓度呈梯度变化，不同引物浓度扩增结果见图3。本实验中当引物浓度为0.1μmol·L-1时，扩增条带较模糊。引物浓度太高，可能会导致非特异性产物的出现，而在本实验中，引物浓度为0.2～0.7μmol·L-1时，扩增的条带基本一致，比较清晰而且条带比较多，但浓度为0.5～0.7μmol·L-1时条带稍弱，综合考虑经济因素，确定最后引物浓度为0.3μmol·L-1。
2.1.4 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响 Mg2+会极大的影响TaqDNA聚合酶活性，还影响着模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物的退火和引物二聚体的形成等[12]。本实验（图4）设置了0.5～3.5mmol·L-1等7个梯度，当Mg2+浓度<1.5mmol·L-1时没有扩增出条带。当Mg2+浓度在2.0、2.5、3.0、3.5mmol·L-1L等4个浓度时，条带清晰，亮度逐渐变亮，条带逐渐减少，最终确定Mg2+浓度为2.0mmol·L-1。
2.1.5 模板DNA含量对ISSR扩增的影响 DNA模板的用量是影响PCR扩增的重要因素。实验结果表明（图5），本试验设计的7个梯度水平的DNA含量，均能扩增出清晰，明亮的条带且无明显差异。这与吴鑫等研究结果相一致[13]。考虑到DNA用量越少越好，因此本实验选择10ng模板DNA含量为ISSR-PCR反应体系的最佳含量。
2.2 退火温度的确定及有效引物筛选 退火温度取决于引物的碱基组成、长度和浓度[14]。一般来说，较低的退火温度可提高PCR反应的敏感性但可能会出现非特异性现象，而较高的退火温度则可提高PCR反应的特异性但却降低了其扩增产率。一般情况下，退火温度应下浮引物Tm值5℃左右[15]，实际实验时应根据所要求的PCR反应的特异性和灵敏度做出相应的调整。因此，优化退火温度的最理想方法是设置一系列对照反应来确定最佳退火温度。本实验设置了51.0、51.2、51.8、52.7、53.8、55.1、56.4、57.7、58.9、59.8、60.5、60.9℃12个退火温度。结果表明（见图6）：在退火温度小于55.1℃时，产物少，当温度大于60.5℃时，无扩增产物，可能是因为退火温度过高，扩增反应受到限制，产物有所减少，当温度为58.9℃时扩增产物多明显，故引物UBC811最适合的退火温度为58.9℃。 利用已优化的泽泻ISSR-PCR反应体系及扩增程序，对备选引物进行筛选（见图7），最终筛选出15条条带清晰、多态性丰富且重复性高的有效引物（表2）。
2.3 ISSR-PCR反应体系的验证 利用引物UBC825对泽泻的21个种源进行ISSR-PCR扩增，结果如图8所示，通过实验优化过的ISSR-PCR反应体系稳定性强，重复性高，扩增条带分离清晰，多态性高，特异性丰富。证明通过单因素试验建立的ISSR-PCR反应体系稳定可靠，能够应用于后续实验研究。
3 结论与讨论
ISSR分子标记技术结合了SSR、RAPD等技术的有点，具有高稳定性和重复性，同时也受到ISSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板DNA等因素的影响[16]。
扩增体系中的影响因子对泽泻ISSR-PCR反应有着重要的影响，每一种因素的变化都有可能导致结果不同，因此确定一个理想的最优反应体系对ISSR-PCR反应是很重要的。本实验发现，dNTPs浓度降低则PCR产量降低；浓度过高容易引起碱基的错配，使产物的特异性下降，因此必须调整好dNTPs的浓度。这与Ou L J等[17]研究相一致。TaqDNA聚合酶浓度过高，容易产生非特异性条带；浓度过低，导致扩增产物产量降低。引物浓度过低，扩增反应过提早结束，扩增条带不够清晰、明亮。这与田艳伶等[18]研究相一致。Mg2+浓度过低，TaqDNA聚合酶活力下降；Mg2+过高又会增加非特异性扩增[19]。DNA含量的高低对扩增产物几乎不产生影响。
本实验采用单因素试验，利用初始程序和体系对影响ISSR-PCR反应的5个因素进行了优化，建立了泽泻ISSR的技术体系。反应终体积是20μL，含有10×Buffer2.0μL、Mg2+2.0mmol·L-1、dNTPs0.4mmol·L-1、引物0.4μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0U、模板DNA10ng、加灭菌ddH2O定容至20μL。ISSR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58.9℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；72℃延伸7min；4℃结束扩增。利用最优体系，从备选引物中筛选出15条多态性高、稳定性好以及重现性好的引物，为泽泻不同种源的遗传多样性研究和亲缘关系评价提供了技术基础。
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（责编：张宏民）