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牛肉及其制品因其营养丰富，深受人们的喜爱。不法商贩用相对廉价的马肉、猪肉、鸭肉等肉类原料，通过各种手段加工，冒充牛肉、羊肉制品进行销售以谋取不当利益，从而严重侵犯消费者的合法权益。聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction，PCR） 是一种使特定核酸片段在体外大量复制的技术，利用这一技术，可以让目标物种的特异DNA片段进行大量复制而进行检测，以鉴别肉制品中是否掺入其他物种。相比于其他检测手段，PCR检测技术具有特异性好，灵敏度高等优势，可以准确地为政府监管提供有利证据。本文对在各大菜市场和超市购买的牛肉及其制品中牛、猪、鸭成分进行了检测，并根据检测经验对鲜牛肉的清洗样和血水进行取样检测，对检测结果进行了结果分析和总结，为掺假牛肉检测技术提供理论和技术支撑，提高检测人员对肉类检测技术的检测和分析能力。
材料与方法
材料与试剂
鲜牛肉，牛肉制品均购自于南京市各大菜市场和超市。
DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0 、Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit、Real Time PCR Procine DNA Detection Kit、TaKaRa Taq（5U/uL）、10×PCR Buffer（Mg2+ plus）、dNTP Mixture（各2.5 mM）、PCR体系预混液Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）宝生物工程（大连）有限公司。
仪器和设备
PikoREAL 96 实时荧光定量PCR仪（96孔板）：美国赛默飞;ST 16R高速冷冻离心机：美国赛默飞;EPS 300电泳仪 Tanon;Universal GenoSens1800凝胶成像仪：上海勤翔;ABI 2720普通PCR仪。
DNA提取
对每个鲜牛肉样品按照不同的部位和步骤取样，分别取原样，清洗样（尽量取肉的中心位置，用自来水反复清洗），血水（浸出到包装袋里的血水），对采得的样品进行DNA提取，其中血水的DNA提取称样量为100mg。对牛肉卷等牛肉加工样品直接取原样进行DNA提取。DNA的提取均采用试剂盒的说明书方法步骤进行。
荧光定量PCR检测
牛和猪的PCR反应体系均为：预混液20 μL，包括DNA模板0.8μL，2×Premix for Bovine（ Procine）10 μL，Primer Mix for Bovine（ Procine）0.8 μL，Probe Mix for Bovine（ Procine）0.8μL，加ddH2O补足20μL。PCR反应条件为：95℃预变性10 s;PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35.0视为检出牛或猪成分。
鸭的PCR反应体系为：预混液20 μL，包括DNA模板1.6 uL，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10 uL，上下游引物各0.4 uL，Probe 0.8 uL，加ddH2O补足20uL。反应条件为：95℃预变性30 s;PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35视为检出鸭成分。
结果与分析
对各大超市和菜市场购买的50批次鲜牛肉及牛肉制品等样品进行牛、猪、鸭成分检测，检测结果如图1。
由图1可以看出，纯牛肉为36例，占总数的72%。发现一例牛肉掺鸭肉，掺假肉占2%。牛肉中掺有猪血的样品占6%，牛血不易采集，价格贵，且牛血味道难闻，不法商贩为了增加牛肉的重量而使用猪血浸泡牛肉，以获取更高的利润。发现假肉为10例，且均为猪肉造假牛肉。其中纯猪肉为3例，占总数的6%，猪肉之所以能华丽变身为“牛肉”，其中起最大作用的并不是“硼砂”，而是猪血，将事先准备好的猪血、豆粉、糖、盐等混入已经绞碎成片的猪肉中搅拌，同时加入硼砂，经过均匀搅拌后，正规的猪肉就被加工成了外观颜色鲜红的“牛肉”;猪肉中掺牛血数量为7例，占14%，用牛血浸泡猪肉，从鲜肉外观上闻和看都会造成是牛肉的假象。
结论
本文对样品的原样、清洗样（用自来水清洗）、血水进行取样并提取DNA，检测牛、猪、鸭三种成分，发现掺假情况多种多样，有牛肉掺鸭肉，牛肉掺猪血，纯猪肉，猪肉掺牛肉等掺假及造假情况，其中掺假率为2%，造假率为20%。在检测过程中对样品进行清洗，可以洗掉浸泡在肉组织中的血水，只对肉组织进行取样分析，防止不法商贩为了造假牛肉而用猪肉浸泡牛血冒充牛肉，对血水进行提取DNA检测也是此目的。本文只是对日常过程中遇到的掺假案例进行了分析总结，在以后的工作中应多方面关注肉类掺假信息，提高物种鉴定技术，同时在检测过程中，对样品的取样应观察肉样是否是整块肉。如果不是整块肉，应均匀取样，且取样品的红肉部分;如果肉样是整块肉，则应取肉样的中间部位，并进行多次清洗，把血水洗干净，减少因血液浸泡而引起的误判。
馬慧娟 江苏省理化测试中心
材料与方法
材料与试剂
鲜牛肉，牛肉制品均购自于南京市各大菜市场和超市。
DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0 、Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit、Real Time PCR Procine DNA Detection Kit、TaKaRa Taq（5U/uL）、10×PCR Buffer（Mg2+ plus）、dNTP Mixture（各2.5 mM）、PCR体系预混液Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）宝生物工程（大连）有限公司。
仪器和设备
PikoREAL 96 实时荧光定量PCR仪（96孔板）：美国赛默飞;ST 16R高速冷冻离心机：美国赛默飞;EPS 300电泳仪 Tanon;Universal GenoSens1800凝胶成像仪：上海勤翔;ABI 2720普通PCR仪。
DNA提取
对每个鲜牛肉样品按照不同的部位和步骤取样，分别取原样，清洗样（尽量取肉的中心位置，用自来水反复清洗），血水（浸出到包装袋里的血水），对采得的样品进行DNA提取，其中血水的DNA提取称样量为100mg。对牛肉卷等牛肉加工样品直接取原样进行DNA提取。DNA的提取均采用试剂盒的说明书方法步骤进行。
荧光定量PCR检测
牛和猪的PCR反应体系均为：预混液20 μL，包括DNA模板0.8μL，2×Premix for Bovine（ Procine）10 μL，Primer Mix for Bovine（ Procine）0.8 μL，Probe Mix for Bovine（ Procine）0.8μL，加ddH2O补足20μL。PCR反应条件为：95℃预变性10 s;PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35.0视为检出牛或猪成分。
鸭的PCR反应体系为：预混液20 μL，包括DNA模板1.6 uL，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10 uL，上下游引物各0.4 uL，Probe 0.8 uL，加ddH2O补足20uL。反应条件为：95℃预变性30 s;PCR反应：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35视为检出鸭成分。
结果与分析
对各大超市和菜市场购买的50批次鲜牛肉及牛肉制品等样品进行牛、猪、鸭成分检测，检测结果如图1。
由图1可以看出，纯牛肉为36例，占总数的72%。发现一例牛肉掺鸭肉，掺假肉占2%。牛肉中掺有猪血的样品占6%，牛血不易采集，价格贵，且牛血味道难闻，不法商贩为了增加牛肉的重量而使用猪血浸泡牛肉，以获取更高的利润。发现假肉为10例，且均为猪肉造假牛肉。其中纯猪肉为3例，占总数的6%，猪肉之所以能华丽变身为“牛肉”，其中起最大作用的并不是“硼砂”，而是猪血，将事先准备好的猪血、豆粉、糖、盐等混入已经绞碎成片的猪肉中搅拌，同时加入硼砂，经过均匀搅拌后，正规的猪肉就被加工成了外观颜色鲜红的“牛肉”;猪肉中掺牛血数量为7例，占14%，用牛血浸泡猪肉，从鲜肉外观上闻和看都会造成是牛肉的假象。
结论
本文对样品的原样、清洗样（用自来水清洗）、血水进行取样并提取DNA，检测牛、猪、鸭三种成分，发现掺假情况多种多样，有牛肉掺鸭肉，牛肉掺猪血，纯猪肉，猪肉掺牛肉等掺假及造假情况，其中掺假率为2%，造假率为20%。在检测过程中对样品进行清洗，可以洗掉浸泡在肉组织中的血水，只对肉组织进行取样分析，防止不法商贩为了造假牛肉而用猪肉浸泡牛血冒充牛肉，对血水进行提取DNA检测也是此目的。本文只是对日常过程中遇到的掺假案例进行了分析总结，在以后的工作中应多方面关注肉类掺假信息，提高物种鉴定技术，同时在检测过程中，对样品的取样应观察肉样是否是整块肉。如果不是整块肉，应均匀取样，且取样品的红肉部分;如果肉样是整块肉，则应取肉样的中间部位，并进行多次清洗，把血水洗干净，减少因血液浸泡而引起的误判。
馬慧娟 江苏省理化测试中心