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摘要：[目的]研究不同氮素来源（有机氮肥和无机氮肥）对烤烟上部烟叶碳氮代谢及关键基因表达的影响，为进一步调控肥料施用、提高烟叶品质提供理论依据。[方法]在保证用氮量一致的基础上，设无机氮肥和有机氮肥两个处理，烟苗移栽后60、70、80～190 d各采样1次，观察不同处理的细胞超微结构，测定烟叶的总糖、总氮和烟碱含量，并对比分析影响碳氮代谢的关键基因表达。[结果]随着移栽时间的延长，有机氮肥处理上部烟叶细胞中的淀粉颗粒增多，嗜锇颗粒含量增加且体积增大。两种氮肥处理成熟期上部烟叶总糖含量均呈先降低再升高的变化趋势，其中有机氮肥处理上部烟叶的总糖含量相对较高；两处理上部烟叶总氮含量随着生育期的延长呈下降趋势，有机氮肥处理在成熟前期显著低于无机氮肥处理（P<0.05，下同），但移栽后90 d二者趋于一致；两处理上部烟叶烟碱含量在成熟期呈上升趋势，有机氮肥处理的烟碱含量除移栽后80 d显著较低外，其他取样时期均高于无机氮肥处理。碳代谢途径关键基因表达分析结果显示，蔗糖合成酶基因（SuSI）、淀粉合成酶基因（SSI）、颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）、支链淀粉合成酶基因（SBEI）和α-淀粉酶基因（AMML）在成熟后期（移栽后90 d）高表达是导致上部烟叶总糖积累较多的主要原因。氮代谢途径关键基因表达分析结果显示，硝酸盐转运蛋白基因（NRTI）和鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）在有机氮源条件下高表达是导致上部烟叶烟碱含量显著升高的主要原因。[结论]施用有机氮肥有利于成熟期上部烟叶碳氮代谢途径关键基因的表达，从而促进上部烟叶总糖和烟碱含量增加，同时降低总氮含量。
关键词：烤烟；有机氮肥；无机氮肥；上部叶；碳氮代谢；基因表达
中图分类号：S572 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0462-07
0引言
[研究意义]碳氮代谢是烟草的最基本代谢之一（黄树永和陈良存，2005）。碳氮代谢易受土壤、肥料等因素影响（刘卫群等，1998；母少东等，2014），尤其受植烟土壤中的氮素影响显著（李春俭等，2007）。植烟土壤中的氮素主要以无机硝态和铵态氮被植物根系细胞膜上的氮转运蛋白利用，即不同氮素来源与烤烟碳氮代谢的协调程度关系密切（张新要等，2005），而碳氮代谢协调程度及动态变化又决定着烟葉化学成分比例，与烟叶品质关系紧密。烤烟上部烟叶是产量核心，但在大田生长过程中存在含氮化合物含量偏高、含碳化合物含量偏低等问题，造成烟叶内部化学成分不协调，进而导致上部烟叶品质降低（刘芳等，2005；许自成等，2005）。因此，研究不同氮素来源对烤烟上部叶碳氮代谢及其基因表达的影响，对提高上部烟叶品质具有重要意义。[前人研究进展]优质烟叶的生产受烟叶碳氮代谢动态平衡的影响，不同肥料的施用对烟叶碳氮代谢动态平衡影响明显。樊武广等（2012）研究表明，硝酸铵和芝麻饼肥配施作为氮源，烟株的淀粉酶活性及硝酸还原酶等活性较协调，有利于优质烟叶生产。刘维智等（2014）分析了氮素及其形态对烟草碳代谢的影响，结果表明烟草对氮素的吸收能影响其自身的糖代谢过程。王晶等（2016）研究表明，增施生物炭会对烟株的化学成分和香气物质产生影响，抚州烟区以300 kg/ha施炭量处理烟株的化学成分更协调。杨胜男等（2016）提出施用复合有机肥可改变烟叶直链和支链淀粉的比例，促进淀粉积累。张弘等（2016）研究表明，有机物料的施用能改善植烟土壤养分，添加生物炭可显著增加土壤碳氮代谢相关酶活性，进而提高烟株的碳氮代谢，改善烟叶品质。张嘉炜等（2016）研究发现，添加生物炭对烤烟碳氮代谢平衡影响明显，进而影响烤烟总糖、总氮等碳氮化合物含量。牛德新等（2017）提出，烤烟成熟期中部烟叶碳氮代谢关键基因表达量受氮肥施用量影响明显，进而影响烤烟的碳氮代谢平衡。[本研究切入点]目前，关于不同氮素来源尤其是酒糟有机肥对成熟期烤烟上部叶碳氮代谢及基因表达影响的研究鲜有报道。[拟解决的关键问题]通过对烟株施用不同肥料（无机氮肥和有机氮肥），从烤烟上部叶细胞的超微结构、总糖、总氮、烟碱及相关基因表达分析等方面人手，系统研究不同氮素来源对烤烟上部叶碳氮代谢及基因表达的影响，为进一步调控肥料施用、提高上部烟叶品质提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
供试烤烟品种为云烟87。
供试肥料中有机氮肥为金沙酒糟有机肥，购自贵州市金沙县加孟农业专业合作社，总养分6.98%，水含量29.00%，有机质含量74.80%，含氮量3.50%；无机氮肥购自贵州毕节灵丰复肥有限公司，其养分配比为N：P：K=10：10：25。
1.2试验方法
在贵州省毕节市金沙县开化科技园（东经106。11’33.26”、北纬27。29’56.56”）进行试验。试验田土地开阔、平坦、向阳，土壤类型一致，土壤理化性状：碱解氮159.27 mg/kg、速效磷25.36 mg/kg、速效钾308.22 mg/kg、有机质23.7 g/kg，土壤pH 6.36。
试验设有机氮肥和无机氮肥2个处理，其中无机氮肥处理按照当地最佳施肥方式进行，施用复合肥（N：P：K=10：10：25）1050kg/ha；有机氮肥处理参照当地有机烟施肥方式，施用有机肥3000 kg/ha（含N 3.5%），另施用硫酸钾镁和钙镁磷肥各225 kg/ha，以保证与无机施肥处理的钾、磷用量一致。无机氮肥和有机氮肥处理均施用一次基肥，不再进行追肥。
试验采用随机区组设计，每小区面积约330m2，3次重复，共6个小区。采用漂浮育苗方法育苗，成熟期取样4次，即烟苗移栽后60、70、80和90 d各取一次样。取样时随机选5株长势基本相同的烟株，混合选取上部叶片，田间操作时样品快速放人液氮，并在超低温冰箱中保存。每处理3次重复。烤后烟叶样品选取等级为B3F的烟叶。 1.3测定项目及方法
1.3.1细胞超微结构观察 选取成熟期的上部叶片，用刀片交叉切割叶片大小为1-3mm，将切下的叶片放入5%戊二醛溶液（磷酸缓冲液、25%戊二醛溶液和双蒸水）中固定，并置于冰箱内4℃保存，为防止氧化，每隔一周換一次溶液。采用透射电镜观察淀粉粒超微结构。
1.3.2总糖、总氮和烟碱含量测定 取成熟期的上部烟叶，105℃杀青15 min，然后60℃烘干至恒重，处理约12 h。采用德国SEAL AA3流动分析仪测定总糖（YC/T 159-2002）、总氮（YC/T 161-2002）及烟碱（YC/T 160-2002）含量。
1.3.3基因表达分析 选取成熟期5株相同部位、发育基本一致的上部叶，混合取样，快速放人液氮中冷冻保存。采用Trizol法提取烟草叶片总RNA，反转录合成cDNA。根据GenBank发布的碳代谢途径基因（表1）：淀粉合成酶关键基因（SS1）、支链淀粉合成酶关键基因（SBEI）、α-淀粉酶关键基因（AMML）、蔗糖合成酶关键基因（SuS1）、焦磷酸化酶关键基因（AGPase）、颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）；氮代谢基因（表2）：硝酸盐转运蛋白基因（NRTI）、腐胺N-甲基转移酶基因（PMT）、鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）、喹啉酸甲基转移酶基因（QPT），依据以上基因的序列设计扩增引物，以L25为内参基因进行RT-PCR扩增。
1.4统计分析
采用Sigmplot 12.5和SPSS 12.0进行数据处理和统计分析。
2结果与分析
2.1有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶细胞超微结构比较
为探明不同氮素来源对烤烟成熟期上部叶叶片细胞发育结构的影响，通过电镜试验对叶片发育结构进行分析。如图1所示，在移栽后70 d时，两种氮素条件下叶片细胞栅栏组织中叶绿体及其他细胞器均靠近细胞壁分布，与无机氮肥处理相比，有机氮肥处理的上部烟叶液泡膜及叶绿体的被膜间附着高电子密度的物质有所增多，叶绿体所含的淀粉粒和嗜锇颗粒含量多，但体积相对较小。在移栽后90 d时，有机氮肥处理上部烟叶细胞的液泡膜及叶绿体被膜间附着的高电子密度物质较多，叶绿体淀粉粒也较多，嗜锇颗粒含量多且体积大。
2.2有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶总糖含量变化规律
由图2可看出，不同氮肥处理成熟期上部烟叶总糖含量均呈先降低再升高的变化趋势，二者均在移栽后70 d时达最低值。与无机氮肥处理相比，有机氮肥处理上部烟叶在成熟期的总糖含量整体较高，移栽后60和90 d时两处理差异达显著水平（P<0.05，下同）。
2.3有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶总氮含量变化规律
由图3可看出，有机氮肥处理上部烟叶总氮含量在成熟前、中期（移栽后60～80 d）呈逐渐降低趋势，成熟后期（移栽后80～90 d）又有所回升；无机氮肥处理上部烟叶总氮含量在整个成熟期呈下降趋势，但与有机氮肥处理相比，其总氮含量整体较高，在移栽后60～80 d时二者差异均达显著水平。
2.4有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶烟碱含量变化规律
由图4可看出，两种氮肥处理上部烟叶烟碱含量在成熟期整体上呈上升趋势。除移栽后80 d有机氮处理上部烟叶烟碱含量显著低于无机氮肥处理外，其他取样时期有机氮肥处理上部烟叶烟碱含量均高于无机氮处理，其中在移栽后70和90 d时二者差异显著。
2.5有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶碳氮代谢途径关键基因表达分析
2.5.1碳代谢关键基因表达分析 对上部烟叶碳代谢途径关键基因表达进行分析，结果（图5）显示，SuS1和SS1基因在两种施肥条件下的表达模式基本一致，表现为成熟后期（移栽后90 d）有机氮肥处理上部烟叶中的表达量高于无机氮肥处理；AGPase基因在两种施肥处理下均在移栽后70 d时达最大值，有机氮肥处理上部烟叶中的表达量显著高于无机氮肥处理；有机氮肥处理上部烟叶中GBSSI、SBE1和AMML基因的表达量在成熟后期（移栽后90 d）均显著高于无机氮肥处理。整体来看，除AGPase基因外，成熟后期有机氮肥处理烟叶碳代谢途径关键基因在上部烟叶中的表达量均显著高于无机氮肥处理。
2.5.2氮代谢关键基因表达分析 对上部烟叶氮素代谢途径关键基因进行分析，结果（图6）显示，烟叶成熟期NRTl基因在两种施肥条件下均强烈表达，其中有机氮肥处理在移栽后90 d表达量最高，而无机氮肥处理在移栽后70 d表达量最高，表明有机氮肥处理下烟株在成熟后期具有较高的氮素吸收转运能力；PMT基因是合成烟碱的一个最关键基因，该基因在叶片中未检测到表达，与烟碱是在根部合成的结果相一致；QPT基因在两种施肥处理的上部烟叶中均有表达，其中移栽后90 d时在有机氮肥处理上部烟叶中的表达量略高于无机氮肥处理；ODC基因表达量和NRT1基因表达量趋势相一致，说明硝酸盐的吸收和转运与烟碱合成呈正相关。整体分析氮代谢途径基因的表达情况，表明有机氮肥处理上部烟叶在成熟后期仍维持较高的氮代谢水平。
3讨论
碳氮代谢是烤烟最基本的代谢途径（岳红宾，2007），烤烟碳氮代谢途径易受到海拔高度、光照等生态环境因素的影响，此外土壤的供氮量及供氮方式对烤烟碳氮平衡也有一定影响（史宏志等，1999；黄国文和陈良碧，2004；习向银等，2008；杨永霞等，2012）。本研究立足于不同氮素来源（有机氮肥和无机氮肥）对烤烟碳氮代谢的影响，对烟叶细胞的超微结构、总糖、总氮、烟碱及相关基因表达进行系统分析，以期为提高上部烟叶品质提供理论依据。
本研究对烤烟成熟期上部烟叶的细胞超微结构进行比较，结果表明，上部叶在成熟后期（移栽后90 d）其细胞超微结构嗜锇颗粒较多且淀粉颗粒多，说明后期淀粉降解比较充分，与总糖含量后期升高的结果相一致。进一步的基因表达分析结果表明，除AGPase基因外，有机氮肥处理上部烟叶的碳代谢途径关键基因SuS1、GBSSI、SS1、SBE1和AMML在成熟后期的表达量均高于无机氮肥处理，碳代谢途径关键基因高表达是导致上部烟叶糖积累较多的主要原因，与贾宏昉等（2014）研究得出的增施腐熟秸秆可提高烤烟碳代谢相关基因表达的结果相似。
氮素与烟碱合成密不可分（李进平等，2010）。本研究对上部烟叶氮代谢途径进行分析，发现有机氮肥处理上部烟叶总氮含量在移栽后60～80 d显著低于无机氮肥处理，整体上呈下降趋势，而烟碱含量整体上呈上升趋势。与无机氮肥处理相比，总氮含量在移栽后90 d略低但差异不明显，烟碱含量在移栽后80-90 d呈线性上升且移栽后90 d显著较高。进一步的氮代谢途径关键基因分析结果表明，有机氮肥处理上部烟叶的NRT1和ODC基因在成熟后期时表达量显著高于无机氮肥处理，这两个基因高表达是有机氮肥条件下上部烟叶烟碱含量增加的主要原因，因此推测NRT1基因与烟碱的合成也呈正相关。以上结果表明，有机氮肥处理下上部烟叶在成熟后期具有较高的氮素吸收转运能力。但有机氮肥对上部烟叶碳氮代谢的影响是否是通过活化土壤养分，进而影响相应的酶活性（关键酶基因表达增强），还需进一步试验验证。
不同氮素来源对烤烟上部烟叶碳氮代谢影响明显，其中施用有机氮肥有利于成熟期上部烟叶碳氮代谢途径关键基因的表达，从而促进上部烟叶总糖和烟碱含量增加，同时降低总氮含量。
（责任编辑 王晖）
关键词：烤烟；有机氮肥；无机氮肥；上部叶；碳氮代谢；基因表达
中图分类号：S572 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0462-07
0引言
[研究意义]碳氮代谢是烟草的最基本代谢之一（黄树永和陈良存，2005）。碳氮代谢易受土壤、肥料等因素影响（刘卫群等，1998；母少东等，2014），尤其受植烟土壤中的氮素影响显著（李春俭等，2007）。植烟土壤中的氮素主要以无机硝态和铵态氮被植物根系细胞膜上的氮转运蛋白利用，即不同氮素来源与烤烟碳氮代谢的协调程度关系密切（张新要等，2005），而碳氮代谢协调程度及动态变化又决定着烟葉化学成分比例，与烟叶品质关系紧密。烤烟上部烟叶是产量核心，但在大田生长过程中存在含氮化合物含量偏高、含碳化合物含量偏低等问题，造成烟叶内部化学成分不协调，进而导致上部烟叶品质降低（刘芳等，2005；许自成等，2005）。因此，研究不同氮素来源对烤烟上部叶碳氮代谢及其基因表达的影响，对提高上部烟叶品质具有重要意义。[前人研究进展]优质烟叶的生产受烟叶碳氮代谢动态平衡的影响，不同肥料的施用对烟叶碳氮代谢动态平衡影响明显。樊武广等（2012）研究表明，硝酸铵和芝麻饼肥配施作为氮源，烟株的淀粉酶活性及硝酸还原酶等活性较协调，有利于优质烟叶生产。刘维智等（2014）分析了氮素及其形态对烟草碳代谢的影响，结果表明烟草对氮素的吸收能影响其自身的糖代谢过程。王晶等（2016）研究表明，增施生物炭会对烟株的化学成分和香气物质产生影响，抚州烟区以300 kg/ha施炭量处理烟株的化学成分更协调。杨胜男等（2016）提出施用复合有机肥可改变烟叶直链和支链淀粉的比例，促进淀粉积累。张弘等（2016）研究表明，有机物料的施用能改善植烟土壤养分，添加生物炭可显著增加土壤碳氮代谢相关酶活性，进而提高烟株的碳氮代谢，改善烟叶品质。张嘉炜等（2016）研究发现，添加生物炭对烤烟碳氮代谢平衡影响明显，进而影响烤烟总糖、总氮等碳氮化合物含量。牛德新等（2017）提出，烤烟成熟期中部烟叶碳氮代谢关键基因表达量受氮肥施用量影响明显，进而影响烤烟的碳氮代谢平衡。[本研究切入点]目前，关于不同氮素来源尤其是酒糟有机肥对成熟期烤烟上部叶碳氮代谢及基因表达影响的研究鲜有报道。[拟解决的关键问题]通过对烟株施用不同肥料（无机氮肥和有机氮肥），从烤烟上部叶细胞的超微结构、总糖、总氮、烟碱及相关基因表达分析等方面人手，系统研究不同氮素来源对烤烟上部叶碳氮代谢及基因表达的影响，为进一步调控肥料施用、提高上部烟叶品质提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
供试烤烟品种为云烟87。
供试肥料中有机氮肥为金沙酒糟有机肥，购自贵州市金沙县加孟农业专业合作社，总养分6.98%，水含量29.00%，有机质含量74.80%，含氮量3.50%；无机氮肥购自贵州毕节灵丰复肥有限公司，其养分配比为N：P：K=10：10：25。
1.2试验方法
在贵州省毕节市金沙县开化科技园（东经106。11’33.26”、北纬27。29’56.56”）进行试验。试验田土地开阔、平坦、向阳，土壤类型一致，土壤理化性状：碱解氮159.27 mg/kg、速效磷25.36 mg/kg、速效钾308.22 mg/kg、有机质23.7 g/kg，土壤pH 6.36。
试验设有机氮肥和无机氮肥2个处理，其中无机氮肥处理按照当地最佳施肥方式进行，施用复合肥（N：P：K=10：10：25）1050kg/ha；有机氮肥处理参照当地有机烟施肥方式，施用有机肥3000 kg/ha（含N 3.5%），另施用硫酸钾镁和钙镁磷肥各225 kg/ha，以保证与无机施肥处理的钾、磷用量一致。无机氮肥和有机氮肥处理均施用一次基肥，不再进行追肥。
试验采用随机区组设计，每小区面积约330m2，3次重复，共6个小区。采用漂浮育苗方法育苗，成熟期取样4次，即烟苗移栽后60、70、80和90 d各取一次样。取样时随机选5株长势基本相同的烟株，混合选取上部叶片，田间操作时样品快速放人液氮，并在超低温冰箱中保存。每处理3次重复。烤后烟叶样品选取等级为B3F的烟叶。 1.3测定项目及方法
1.3.1细胞超微结构观察 选取成熟期的上部叶片，用刀片交叉切割叶片大小为1-3mm，将切下的叶片放入5%戊二醛溶液（磷酸缓冲液、25%戊二醛溶液和双蒸水）中固定，并置于冰箱内4℃保存，为防止氧化，每隔一周換一次溶液。采用透射电镜观察淀粉粒超微结构。
1.3.2总糖、总氮和烟碱含量测定 取成熟期的上部烟叶，105℃杀青15 min，然后60℃烘干至恒重，处理约12 h。采用德国SEAL AA3流动分析仪测定总糖（YC/T 159-2002）、总氮（YC/T 161-2002）及烟碱（YC/T 160-2002）含量。
1.3.3基因表达分析 选取成熟期5株相同部位、发育基本一致的上部叶，混合取样，快速放人液氮中冷冻保存。采用Trizol法提取烟草叶片总RNA，反转录合成cDNA。根据GenBank发布的碳代谢途径基因（表1）：淀粉合成酶关键基因（SS1）、支链淀粉合成酶关键基因（SBEI）、α-淀粉酶关键基因（AMML）、蔗糖合成酶关键基因（SuS1）、焦磷酸化酶关键基因（AGPase）、颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSSI）；氮代谢基因（表2）：硝酸盐转运蛋白基因（NRTI）、腐胺N-甲基转移酶基因（PMT）、鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）、喹啉酸甲基转移酶基因（QPT），依据以上基因的序列设计扩增引物，以L25为内参基因进行RT-PCR扩增。
1.4统计分析
采用Sigmplot 12.5和SPSS 12.0进行数据处理和统计分析。
2结果与分析
2.1有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶细胞超微结构比较
为探明不同氮素来源对烤烟成熟期上部叶叶片细胞发育结构的影响，通过电镜试验对叶片发育结构进行分析。如图1所示，在移栽后70 d时，两种氮素条件下叶片细胞栅栏组织中叶绿体及其他细胞器均靠近细胞壁分布，与无机氮肥处理相比，有机氮肥处理的上部烟叶液泡膜及叶绿体的被膜间附着高电子密度的物质有所增多，叶绿体所含的淀粉粒和嗜锇颗粒含量多，但体积相对较小。在移栽后90 d时，有机氮肥处理上部烟叶细胞的液泡膜及叶绿体被膜间附着的高电子密度物质较多，叶绿体淀粉粒也较多，嗜锇颗粒含量多且体积大。
2.2有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶总糖含量变化规律
由图2可看出，不同氮肥处理成熟期上部烟叶总糖含量均呈先降低再升高的变化趋势，二者均在移栽后70 d时达最低值。与无机氮肥处理相比，有机氮肥处理上部烟叶在成熟期的总糖含量整体较高，移栽后60和90 d时两处理差异达显著水平（P<0.05，下同）。
2.3有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶总氮含量变化规律
由图3可看出，有机氮肥处理上部烟叶总氮含量在成熟前、中期（移栽后60～80 d）呈逐渐降低趋势，成熟后期（移栽后80～90 d）又有所回升；无机氮肥处理上部烟叶总氮含量在整个成熟期呈下降趋势，但与有机氮肥处理相比，其总氮含量整体较高，在移栽后60～80 d时二者差异均达显著水平。
2.4有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶烟碱含量变化规律
由图4可看出，两种氮肥处理上部烟叶烟碱含量在成熟期整体上呈上升趋势。除移栽后80 d有机氮处理上部烟叶烟碱含量显著低于无机氮肥处理外，其他取样时期有机氮肥处理上部烟叶烟碱含量均高于无机氮处理，其中在移栽后70和90 d时二者差异显著。
2.5有机氮肥和无机氮肥条件下烤烟成熟期上部烟叶碳氮代谢途径关键基因表达分析
2.5.1碳代谢关键基因表达分析 对上部烟叶碳代谢途径关键基因表达进行分析，结果（图5）显示，SuS1和SS1基因在两种施肥条件下的表达模式基本一致，表现为成熟后期（移栽后90 d）有机氮肥处理上部烟叶中的表达量高于无机氮肥处理；AGPase基因在两种施肥处理下均在移栽后70 d时达最大值，有机氮肥处理上部烟叶中的表达量显著高于无机氮肥处理；有机氮肥处理上部烟叶中GBSSI、SBE1和AMML基因的表达量在成熟后期（移栽后90 d）均显著高于无机氮肥处理。整体来看，除AGPase基因外，成熟后期有机氮肥处理烟叶碳代谢途径关键基因在上部烟叶中的表达量均显著高于无机氮肥处理。
2.5.2氮代谢关键基因表达分析 对上部烟叶氮素代谢途径关键基因进行分析，结果（图6）显示，烟叶成熟期NRTl基因在两种施肥条件下均强烈表达，其中有机氮肥处理在移栽后90 d表达量最高，而无机氮肥处理在移栽后70 d表达量最高，表明有机氮肥处理下烟株在成熟后期具有较高的氮素吸收转运能力；PMT基因是合成烟碱的一个最关键基因，该基因在叶片中未检测到表达，与烟碱是在根部合成的结果相一致；QPT基因在两种施肥处理的上部烟叶中均有表达，其中移栽后90 d时在有机氮肥处理上部烟叶中的表达量略高于无机氮肥处理；ODC基因表达量和NRT1基因表达量趋势相一致，说明硝酸盐的吸收和转运与烟碱合成呈正相关。整体分析氮代谢途径基因的表达情况，表明有机氮肥处理上部烟叶在成熟后期仍维持较高的氮代谢水平。
3讨论
碳氮代谢是烤烟最基本的代谢途径（岳红宾，2007），烤烟碳氮代谢途径易受到海拔高度、光照等生态环境因素的影响，此外土壤的供氮量及供氮方式对烤烟碳氮平衡也有一定影响（史宏志等，1999；黄国文和陈良碧，2004；习向银等，2008；杨永霞等，2012）。本研究立足于不同氮素来源（有机氮肥和无机氮肥）对烤烟碳氮代谢的影响，对烟叶细胞的超微结构、总糖、总氮、烟碱及相关基因表达进行系统分析，以期为提高上部烟叶品质提供理论依据。
本研究对烤烟成熟期上部烟叶的细胞超微结构进行比较，结果表明，上部叶在成熟后期（移栽后90 d）其细胞超微结构嗜锇颗粒较多且淀粉颗粒多，说明后期淀粉降解比较充分，与总糖含量后期升高的结果相一致。进一步的基因表达分析结果表明，除AGPase基因外，有机氮肥处理上部烟叶的碳代谢途径关键基因SuS1、GBSSI、SS1、SBE1和AMML在成熟后期的表达量均高于无机氮肥处理，碳代谢途径关键基因高表达是导致上部烟叶糖积累较多的主要原因，与贾宏昉等（2014）研究得出的增施腐熟秸秆可提高烤烟碳代谢相关基因表达的结果相似。
氮素与烟碱合成密不可分（李进平等，2010）。本研究对上部烟叶氮代谢途径进行分析，发现有机氮肥处理上部烟叶总氮含量在移栽后60～80 d显著低于无机氮肥处理，整体上呈下降趋势，而烟碱含量整体上呈上升趋势。与无机氮肥处理相比，总氮含量在移栽后90 d略低但差异不明显，烟碱含量在移栽后80-90 d呈线性上升且移栽后90 d显著较高。进一步的氮代谢途径关键基因分析结果表明，有机氮肥处理上部烟叶的NRT1和ODC基因在成熟后期时表达量显著高于无机氮肥处理，这两个基因高表达是有机氮肥条件下上部烟叶烟碱含量增加的主要原因，因此推测NRT1基因与烟碱的合成也呈正相关。以上结果表明，有机氮肥处理下上部烟叶在成熟后期具有较高的氮素吸收转运能力。但有机氮肥对上部烟叶碳氮代谢的影响是否是通过活化土壤养分，进而影响相应的酶活性（关键酶基因表达增强），还需进一步试验验证。
不同氮素来源对烤烟上部烟叶碳氮代谢影响明显，其中施用有机氮肥有利于成熟期上部烟叶碳氮代谢途径关键基因的表达，从而促进上部烟叶总糖和烟碱含量增加，同时降低总氮含量。
（责任编辑 王晖）