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[摘要]目的：建立并验证慢性应激抑郁型黄褐斑动物模型， 并与现有其他模型进行比较。方法：在注射黄体酮同时， 进行慢性轻度不可预见的应激刺激，并紫外线局部照射。结果：黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁法造模较其他方法更能导致皮肤丙二醛（Malondialdehyde，MDA）升高和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）降低以及皮肤黑素细胞的增加， 并且具有抑郁症的行动学表现。与空白组比较， 经慢性轻度不可预见性应激刺激的动物体重显著下降，敞箱试验中穿格次数、理毛时间和次数、直立次数得分显著下降，液体消耗试验中糖水消耗和糖水偏爱百分比明显下降， 而纯水消耗显著提高。结论：黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁法建立的抑郁型黄褐斑豚鼠多因素模型获得成功。与现有其他模型比较，其皮肤MDA、SOD与皮肤黑素细胞等客观指标的变化也更加接近人类黄褐斑的病变。
[关键词]黄褐斑；抑郁症；动物模型
[中图分类号]R758.4+2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）03-0349-06
黄褐斑是临床的常见病之一， 近年来国内外学者尝试运用激光[1]和强脉冲光治疗黄褐斑取得了一些进展，为黄褐斑的治疗来了新的契机[2-3]。但激光照射对人表皮黑素细胞生物学的影响却并不十分清楚。基础研究显得尤为重要，使得黄褐斑的动物模型的研究成为非常重要的课题。查阅以往关于黄褐斑的动物模型研究文献，国内外均有报道，主要以小鼠局部紫外光照射[4-5]、内用雌激素全身攻击[6]、微量定点注射辅以紫外线照射[7]等方法进行造模，由于黄褐斑是多因素致病机理而产生，单一因素造模法建立的动物模型代表性比较差。综合其诸多因素的考虑，笔者通过紫外线照射、雌激素全身攻击、慢性轻度不可预见的应激刺激建立黄褐斑实验动物模型。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物：健康纯白色雌性豚鼠60只，清洁级，体质量（280±12）g，随机分为5组，每组12只，由深圳市人民医院实验动物中心提供。
1.1.2 实验药品和试剂：黄体酮注射液1ml：20mg（上海通用药业股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、酪氨酸（Tyr）检测试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；HMB45 （melanoma 黑素瘤） 鼠抗人单克隆抗体即用型试剂盒（福建迈新公司）；中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.3 实验器材：紫外线照射灯（UVB，德国Waldmann）；UV2401PC紫外分光光度计（日本岛津公司） ；CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统2000型 （空军总医院与北京航空航天大学共同研制）。
1.2 动物造模方法：造模时间28天。①空白组：以10% NaS2 水溶液背部脱毛， 每周脱毛一次，背部裸露约2.0cm×2.0cm面积皮肤1块；每天肌肉注射注射用水，5ml/kg体质量；②紫外线组[4]：同正常组脱毛处理，每日以波长为320nm 的中波紫外线（UVB）照射豚鼠背部皮肤1次，照射时间30min，动物与光源的距离为20cm；③黄体酮组[6]：同正常组脱毛处理，每日8：00～9：00交替于豚鼠两后腿肌肉注射0.4%黄体酮， 5ml/kg体质量；④紫外线+黄体酮组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法和黄体酮注射方法同紫外线组和黄体酮组；⑤紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法和黄体酮注射方法同紫外线组和黄体酮组。同时进行慢性轻度不可预见性的应激抑郁豚鼠模型方案： 按照文献[8-9]并略加改进， 将明暗颠倒24h、2h行为限制、停食24h、停水24h、夹尾1 min、40 ℃水中游泳5min、电击足底5s（30 伏电压）、摇晃5min （160HZ）、40℃环境5 min共9种刺激随机安排到28日内，每日1 种， 每种刺激出现2 次，使动物不能预料刺激的发生，同种刺激不能重复出现。
1.3 测定指标与方法
1.3.1 皮肤黑素细胞的病理形态学观察：取豚鼠明显的色变去毛皮肤1块（0.2cm×0.2cm） ，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。再经脱蜡至水化、抗原修复后，用HMB45 （melanoma 黑素瘤） 为第一抗体，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗做阴性对照。
1.3.2 显微镜图像分析[10]：采用病理图像分析系统对目标图像进行定量分析，随机选择每张切片在显微镜物镜400X下5个不重叠视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野中的目标个数、阳性目标面积、平均灰度值与平均光密度值等。
1.3.3 MDA、SOD及酪氨酸活性测定：切取脱毛部位皮肤0.2g ，用预冷生理盐水（4℃） 冲洗，除尽杂质，拭干，分别放入有2.0ml 预冷生理盐水的小试管内，用细胞粉碎机匀浆4次，每次5s。匀浆后以3500 r/min 离心15 min，取上清液采用试剂盒检测MDA、SOD及酪氨酸活性。
1.4 行为学实验方法
1.4.1 敞箱试验[11]：敞箱装置由不透明材料制成， 底面为76cm×76cm的正方形并被等分为25 个等边方格， 周围有高42cm的围墙。于第29天7：30～12：00 之间在安静的房间内进行此项试验观察。将豚鼠置于中心方格内，观察豚鼠在5min内中央格停留时间、穿越格数（四爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分），彻底清洁敞箱后再进行下一只豚鼠的观察。实验要求在单盲的条件下进行，减少人为的误差。观察指标：豚鼠穿格次数、理毛时间和次数、直立次数。反复进行4次，每次间隔3min。取后3次的数据计算平均数用于统计处理。
1.4.2 甩尾实验[12]：用一块软布轻轻裹住实验豚鼠的身躯仅露出尾巴， 使之不能逃脱但不能过于束缚。将鼠尾尖端约1.5cm 部分浸入53℃的水浴内， 同时用秒表测出鼠尾从浸入到甩出水面的时间（精确到0.1s）。连续做4 次， 每次间隔30s。统计取后3 次的数据计算平均数。 1.4.3 液体消耗试验[13]：实验第25天在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水， 每笼同时放置2 个水瓶，第一个24h，两瓶均装有1% 蔗糖水， 随后的24h，一个瓶装1%蔗糖水，一个瓶装纯水。第27天23 h的禁食禁水，第28天进行动物的基础糖水/ 纯水消耗试验， 同时给予每只豚鼠定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水。24h后取走两瓶并称重。第29天计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱（糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%）。
1.4.4 体质量变化：观察不同因素刺激下豚鼠体质量增加的区别，分别测量每组豚鼠在实验开始时和第28天试验结束时的体质量，并进行分析。
1.5 统计学方法：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异的显著性检验运用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肉眼观察实验豚鼠照射情况：紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组造模动物1周后出现精神差、反应迟钝、进食减少、体重下降、毛发易脱落、小便量增多。两周后紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组较其他组上述症状明显加重，相比空白组豚鼠精神好、反应敏捷、毛发浓密有光泽、饮食、大小便正常。除空白对照组以外，其余四组第28天，背部皮肤色素沉着加深，呈灰褐色。紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组较其他组明显。
2.2 皮肤黑素细胞的病理形态学观察：与空白组（图1A）比较，紫外线组豚鼠皮肤HMB45标记阳性的黑素细胞少量增多，表皮基底细胞和棘细胞层中可见单个散在分布的黑素细胞（图1B）；黄体酮组豚鼠皮肤表皮基底层和棘细胞层中可见散在少量分布的HMB45标记阳性的黑素细胞（图1C）；紫外线+黄体酮组豚鼠皮肤表皮基底层和棘细胞层中可见多个散在分布的HMB45标记阳性的黑素细胞（图1D）；紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组豚鼠皮肤HMB45标记阳性的黑素细胞明显增多，多个成簇分布于表皮基底细胞和棘细胞层中，呈强阳性反应（图1E）。
2.3 黑素阳性目标的计算机图像分析
2.3.1各组豚鼠皮肤黑素细胞个数、数密度比较：各组豚鼠皮肤黑素细胞的个数均较空白组有所增加，其中紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组有极显著性差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组黑素细胞个数与其他各组有显著差异，具有统计学意义（F=266.729，P<0.01）。各组数密度明显高于空白组，尤其是紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组可见与空白组有极显著差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组数密度与其他各组有显著差异，具有统计学意义（F=84.896，P<0.01）（表1）。
2.3.2各组豚鼠表皮黑色素沉着深浅度[14]：结果显示，与空白组比较，其他四组的平均光密度值均较空白组升高，除黄体酮组外平均灰度值较空白组有所下降。其中，紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组豚鼠平均光密度值、平均灰度值有极显著性差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组平均光密度值、平均灰度值与其他各组有显著差异，存在统计学意义（F=17.399，P<0.01；F=39.011，P<0.01）（表2）。
2.4行为学测试
2.4.1敞箱实验：黄体酮+紫外线+应激抑郁组的穿格次数、直立次数、理毛时间、理毛次数均较空白组有所减少，差异有统计学意义（P<0.05），其他组与空白组差异性比较均无统计学意义（P>0.05）提示慢性不可预见性的应激刺激28天后的豚鼠出现了抑郁的现象（表3）。
2.4.2 甩尾实验：紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+应激抑郁组甩尾时间均较空白组显著延长，差异有统计学意义（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组甩尾时间与其他各组有显著差异，具有统计学意义（F=9.469，P<0.01）（表4）。
2.4.3体质量增加的计算：在造模的28天中，各组豚鼠的体质量均有所增加。紫外线+黄体酮组和黄体酮+紫外线+应激抑郁模型组较正常组的体质量增加量有所减少，差异有统计学意义（P<0.05）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组体质量增加量较其他各组显著减少，差异具有统计学意义（F=24.664，P<0.01）。进一步提示慢性应激刺激法导致抑郁后对体质量的影响最大（表5）。
2.4.4糖水消耗实验：慢性应激刺激对豚鼠液体消耗实验的影响，黄体酮十紫外线+抑郁模型组的糖水消耗显著低于空白组（P<0.05），各组总液体消耗无明显差异（P>0.05）。紫外线+黄体酮组糖水消耗和糖水偏爱百分比显著低于空白组（P<0.05）。紫外线+黄体酮+应激抑郁组糖水消耗、糖水偏爱百分比均极显著低于空白组（P<0.01）。纯水消耗显著提高，差异有统计学意义（P<0.01）（表6）。
2.5对皮肤MDA、SOD 含量的影响：在5组中，紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组模型豚鼠皮肤的MDA水平均较正常组升高，SOD活性较正常组有所下降，有统计学差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组豚鼠皮肤MDA、SOD较其他组显著性差异（F=19.763，P<0.01；F=53.264，P<0.01）。提示此种模型建立对于豚鼠皮肤MDA、SOD的活性影响非常大（表7）。
2.6 酪氨酸含量测定：紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组酪氨酸含量与空白组比较明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组酪氨酸含量较其他各组明显升高，差异具有统计学意义（F=59.552，P<0.01）（表8）。
3 讨论 普遍认为黄褐斑发病原因可能与紫外线照射、遗传因素、情绪变化、内分泌失调、药物等多种因素密切相关[15]，现阶段虽然治疗方法较多，但疗效较差。因此，进一步客观研究黄褐斑动物模型在研究黄褐斑的治疗机制过程中有着重要的意义。查阅以往文献黄褐斑动物模型都是从单一的致病机制来建立黄褐斑动物模型，研究结果也只是从一个方面来反映了疾病的表现，因此不能综合全面的表达黄褐斑病因病机。赵广等[15]调查200例黄褐斑患者研究发现，自觉黄褐斑的发生和加重与情绪抑郁相关的患者占54.5%。其中有部分患者面部黄褐斑是由于家中突发的恶性事件所诱发的。所以黄褐斑动物模型中应该考虑情绪抑郁导致的发病因素，汪南玥等[16]考虑到黄褐斑的中医辨证分型中以肝郁型为多见，采用雌激素全身攻击、慢性束缚法、局部紫外光照射法建立多因素黄褐斑豚鼠肝郁模型，其豚鼠皮肤黑素细胞和MDA、SOD等客观指标的变化较其他模型也更加类似人类黄褐斑的病变和表现。目前广泛应用慢性轻度不可预见的应激来模拟制作抑郁症动物模型， 更类似于人类抑郁症发病机理[17]。研究表明抑郁症的首要促发因素是长期、低强度的日常应激性生活事件，而且在制作抑郁动物模型中，模型成功的关键是应激因素的多变性和不可预测性， 并且没有一种应激因子单独应用可产生理想效应， 反之没有一种应激因素是抑郁模型成功所必不可少的[18]。所以单一的慢性束缚法造成抑郁，某种程度上很难具备典型抑郁模型的特征，但为笔者制作更加科学的黄褐斑动物模型提供了思路。综合其诸多因素的考虑，因此建立更加科学的黄褐斑动物模型，不仅仅是病理状态上的相似性，还因考虑精神方面的因素。建立多因素黄褐斑动物模型更全面体现黄褐斑的病理机制。
皮肤黑色素病理形态学研究结果与生化指标检测是判断黄褐斑的动物模型是否成功最主要指标。而前者是直接、最客观的指标。光镜下可见各组间比较紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组黑色素细胞较空白组豚鼠黑素阳性细胞明显增多，与过伟峰等结果一致[6]。计算机病理图象学定量分析结果显示， 紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组同其他组比较豚鼠数密度、平均光密度值、平均灰度值有极显著性差异，具有统计学意义。其MDA、SOD等生化指标检测与黄褐斑主要临床特征类似。说明多重因素造模后较其他单一因素组豚鼠黄褐斑动物模型更加接近人类黄褐斑变病特征，并且具有抑郁症的行动学表现。该模型的建立为将来探讨黄褐斑动物模型提供了基础和思路，为研究黄褐斑治疗方法提供了较为理想的动物模型。
[参考文献]
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[收稿日期]2012-12-05 [修回日期]2013-01-26
编辑/张惠娟
[关键词]黄褐斑；抑郁症；动物模型
[中图分类号]R758.4+2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）03-0349-06
黄褐斑是临床的常见病之一， 近年来国内外学者尝试运用激光[1]和强脉冲光治疗黄褐斑取得了一些进展，为黄褐斑的治疗来了新的契机[2-3]。但激光照射对人表皮黑素细胞生物学的影响却并不十分清楚。基础研究显得尤为重要，使得黄褐斑的动物模型的研究成为非常重要的课题。查阅以往关于黄褐斑的动物模型研究文献，国内外均有报道，主要以小鼠局部紫外光照射[4-5]、内用雌激素全身攻击[6]、微量定点注射辅以紫外线照射[7]等方法进行造模，由于黄褐斑是多因素致病机理而产生，单一因素造模法建立的动物模型代表性比较差。综合其诸多因素的考虑，笔者通过紫外线照射、雌激素全身攻击、慢性轻度不可预见的应激刺激建立黄褐斑实验动物模型。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物：健康纯白色雌性豚鼠60只，清洁级，体质量（280±12）g，随机分为5组，每组12只，由深圳市人民医院实验动物中心提供。
1.1.2 实验药品和试剂：黄体酮注射液1ml：20mg（上海通用药业股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、酪氨酸（Tyr）检测试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；HMB45 （melanoma 黑素瘤） 鼠抗人单克隆抗体即用型试剂盒（福建迈新公司）；中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.3 实验器材：紫外线照射灯（UVB，德国Waldmann）；UV2401PC紫外分光光度计（日本岛津公司） ；CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统2000型 （空军总医院与北京航空航天大学共同研制）。
1.2 动物造模方法：造模时间28天。①空白组：以10% NaS2 水溶液背部脱毛， 每周脱毛一次，背部裸露约2.0cm×2.0cm面积皮肤1块；每天肌肉注射注射用水，5ml/kg体质量；②紫外线组[4]：同正常组脱毛处理，每日以波长为320nm 的中波紫外线（UVB）照射豚鼠背部皮肤1次，照射时间30min，动物与光源的距离为20cm；③黄体酮组[6]：同正常组脱毛处理，每日8：00～9：00交替于豚鼠两后腿肌肉注射0.4%黄体酮， 5ml/kg体质量；④紫外线+黄体酮组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法和黄体酮注射方法同紫外线组和黄体酮组；⑤紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法和黄体酮注射方法同紫外线组和黄体酮组。同时进行慢性轻度不可预见性的应激抑郁豚鼠模型方案： 按照文献[8-9]并略加改进， 将明暗颠倒24h、2h行为限制、停食24h、停水24h、夹尾1 min、40 ℃水中游泳5min、电击足底5s（30 伏电压）、摇晃5min （160HZ）、40℃环境5 min共9种刺激随机安排到28日内，每日1 种， 每种刺激出现2 次，使动物不能预料刺激的发生，同种刺激不能重复出现。
1.3 测定指标与方法
1.3.1 皮肤黑素细胞的病理形态学观察：取豚鼠明显的色变去毛皮肤1块（0.2cm×0.2cm） ，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。再经脱蜡至水化、抗原修复后，用HMB45 （melanoma 黑素瘤） 为第一抗体，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗做阴性对照。
1.3.2 显微镜图像分析[10]：采用病理图像分析系统对目标图像进行定量分析，随机选择每张切片在显微镜物镜400X下5个不重叠视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野中的目标个数、阳性目标面积、平均灰度值与平均光密度值等。
1.3.3 MDA、SOD及酪氨酸活性测定：切取脱毛部位皮肤0.2g ，用预冷生理盐水（4℃） 冲洗，除尽杂质，拭干，分别放入有2.0ml 预冷生理盐水的小试管内，用细胞粉碎机匀浆4次，每次5s。匀浆后以3500 r/min 离心15 min，取上清液采用试剂盒检测MDA、SOD及酪氨酸活性。
1.4 行为学实验方法
1.4.1 敞箱试验[11]：敞箱装置由不透明材料制成， 底面为76cm×76cm的正方形并被等分为25 个等边方格， 周围有高42cm的围墙。于第29天7：30～12：00 之间在安静的房间内进行此项试验观察。将豚鼠置于中心方格内，观察豚鼠在5min内中央格停留时间、穿越格数（四爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分），彻底清洁敞箱后再进行下一只豚鼠的观察。实验要求在单盲的条件下进行，减少人为的误差。观察指标：豚鼠穿格次数、理毛时间和次数、直立次数。反复进行4次，每次间隔3min。取后3次的数据计算平均数用于统计处理。
1.4.2 甩尾实验[12]：用一块软布轻轻裹住实验豚鼠的身躯仅露出尾巴， 使之不能逃脱但不能过于束缚。将鼠尾尖端约1.5cm 部分浸入53℃的水浴内， 同时用秒表测出鼠尾从浸入到甩出水面的时间（精确到0.1s）。连续做4 次， 每次间隔30s。统计取后3 次的数据计算平均数。 1.4.3 液体消耗试验[13]：实验第25天在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水， 每笼同时放置2 个水瓶，第一个24h，两瓶均装有1% 蔗糖水， 随后的24h，一个瓶装1%蔗糖水，一个瓶装纯水。第27天23 h的禁食禁水，第28天进行动物的基础糖水/ 纯水消耗试验， 同时给予每只豚鼠定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水。24h后取走两瓶并称重。第29天计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱（糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%）。
1.4.4 体质量变化：观察不同因素刺激下豚鼠体质量增加的区别，分别测量每组豚鼠在实验开始时和第28天试验结束时的体质量，并进行分析。
1.5 统计学方法：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异的显著性检验运用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肉眼观察实验豚鼠照射情况：紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组造模动物1周后出现精神差、反应迟钝、进食减少、体重下降、毛发易脱落、小便量增多。两周后紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组较其他组上述症状明显加重，相比空白组豚鼠精神好、反应敏捷、毛发浓密有光泽、饮食、大小便正常。除空白对照组以外，其余四组第28天，背部皮肤色素沉着加深，呈灰褐色。紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组较其他组明显。
2.2 皮肤黑素细胞的病理形态学观察：与空白组（图1A）比较，紫外线组豚鼠皮肤HMB45标记阳性的黑素细胞少量增多，表皮基底细胞和棘细胞层中可见单个散在分布的黑素细胞（图1B）；黄体酮组豚鼠皮肤表皮基底层和棘细胞层中可见散在少量分布的HMB45标记阳性的黑素细胞（图1C）；紫外线+黄体酮组豚鼠皮肤表皮基底层和棘细胞层中可见多个散在分布的HMB45标记阳性的黑素细胞（图1D）；紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组豚鼠皮肤HMB45标记阳性的黑素细胞明显增多，多个成簇分布于表皮基底细胞和棘细胞层中，呈强阳性反应（图1E）。
2.3 黑素阳性目标的计算机图像分析
2.3.1各组豚鼠皮肤黑素细胞个数、数密度比较：各组豚鼠皮肤黑素细胞的个数均较空白组有所增加，其中紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组有极显著性差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组黑素细胞个数与其他各组有显著差异，具有统计学意义（F=266.729，P<0.01）。各组数密度明显高于空白组，尤其是紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组可见与空白组有极显著差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组数密度与其他各组有显著差异，具有统计学意义（F=84.896，P<0.01）（表1）。
2.3.2各组豚鼠表皮黑色素沉着深浅度[14]：结果显示，与空白组比较，其他四组的平均光密度值均较空白组升高，除黄体酮组外平均灰度值较空白组有所下降。其中，紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组豚鼠平均光密度值、平均灰度值有极显著性差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组平均光密度值、平均灰度值与其他各组有显著差异，存在统计学意义（F=17.399，P<0.01；F=39.011，P<0.01）（表2）。
2.4行为学测试
2.4.1敞箱实验：黄体酮+紫外线+应激抑郁组的穿格次数、直立次数、理毛时间、理毛次数均较空白组有所减少，差异有统计学意义（P<0.05），其他组与空白组差异性比较均无统计学意义（P>0.05）提示慢性不可预见性的应激刺激28天后的豚鼠出现了抑郁的现象（表3）。
2.4.2 甩尾实验：紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+应激抑郁组甩尾时间均较空白组显著延长，差异有统计学意义（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组甩尾时间与其他各组有显著差异，具有统计学意义（F=9.469，P<0.01）（表4）。
2.4.3体质量增加的计算：在造模的28天中，各组豚鼠的体质量均有所增加。紫外线+黄体酮组和黄体酮+紫外线+应激抑郁模型组较正常组的体质量增加量有所减少，差异有统计学意义（P<0.05）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组体质量增加量较其他各组显著减少，差异具有统计学意义（F=24.664，P<0.01）。进一步提示慢性应激刺激法导致抑郁后对体质量的影响最大（表5）。
2.4.4糖水消耗实验：慢性应激刺激对豚鼠液体消耗实验的影响，黄体酮十紫外线+抑郁模型组的糖水消耗显著低于空白组（P<0.05），各组总液体消耗无明显差异（P>0.05）。紫外线+黄体酮组糖水消耗和糖水偏爱百分比显著低于空白组（P<0.05）。紫外线+黄体酮+应激抑郁组糖水消耗、糖水偏爱百分比均极显著低于空白组（P<0.01）。纯水消耗显著提高，差异有统计学意义（P<0.01）（表6）。
2.5对皮肤MDA、SOD 含量的影响：在5组中，紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组模型豚鼠皮肤的MDA水平均较正常组升高，SOD活性较正常组有所下降，有统计学差异（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组豚鼠皮肤MDA、SOD较其他组显著性差异（F=19.763，P<0.01；F=53.264，P<0.01）。提示此种模型建立对于豚鼠皮肤MDA、SOD的活性影响非常大（表7）。
2.6 酪氨酸含量测定：紫外线+黄体酮组和紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组酪氨酸含量与空白组比较明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。采用单因素方差分析紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组酪氨酸含量较其他各组明显升高，差异具有统计学意义（F=59.552，P<0.01）（表8）。
3 讨论 普遍认为黄褐斑发病原因可能与紫外线照射、遗传因素、情绪变化、内分泌失调、药物等多种因素密切相关[15]，现阶段虽然治疗方法较多，但疗效较差。因此，进一步客观研究黄褐斑动物模型在研究黄褐斑的治疗机制过程中有着重要的意义。查阅以往文献黄褐斑动物模型都是从单一的致病机制来建立黄褐斑动物模型，研究结果也只是从一个方面来反映了疾病的表现，因此不能综合全面的表达黄褐斑病因病机。赵广等[15]调查200例黄褐斑患者研究发现，自觉黄褐斑的发生和加重与情绪抑郁相关的患者占54.5%。其中有部分患者面部黄褐斑是由于家中突发的恶性事件所诱发的。所以黄褐斑动物模型中应该考虑情绪抑郁导致的发病因素，汪南玥等[16]考虑到黄褐斑的中医辨证分型中以肝郁型为多见，采用雌激素全身攻击、慢性束缚法、局部紫外光照射法建立多因素黄褐斑豚鼠肝郁模型，其豚鼠皮肤黑素细胞和MDA、SOD等客观指标的变化较其他模型也更加类似人类黄褐斑的病变和表现。目前广泛应用慢性轻度不可预见的应激来模拟制作抑郁症动物模型， 更类似于人类抑郁症发病机理[17]。研究表明抑郁症的首要促发因素是长期、低强度的日常应激性生活事件，而且在制作抑郁动物模型中，模型成功的关键是应激因素的多变性和不可预测性， 并且没有一种应激因子单独应用可产生理想效应， 反之没有一种应激因素是抑郁模型成功所必不可少的[18]。所以单一的慢性束缚法造成抑郁，某种程度上很难具备典型抑郁模型的特征，但为笔者制作更加科学的黄褐斑动物模型提供了思路。综合其诸多因素的考虑，因此建立更加科学的黄褐斑动物模型，不仅仅是病理状态上的相似性，还因考虑精神方面的因素。建立多因素黄褐斑动物模型更全面体现黄褐斑的病理机制。
皮肤黑色素病理形态学研究结果与生化指标检测是判断黄褐斑的动物模型是否成功最主要指标。而前者是直接、最客观的指标。光镜下可见各组间比较紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组黑色素细胞较空白组豚鼠黑素阳性细胞明显增多，与过伟峰等结果一致[6]。计算机病理图象学定量分析结果显示， 紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组同其他组比较豚鼠数密度、平均光密度值、平均灰度值有极显著性差异，具有统计学意义。其MDA、SOD等生化指标检测与黄褐斑主要临床特征类似。说明多重因素造模后较其他单一因素组豚鼠黄褐斑动物模型更加接近人类黄褐斑变病特征，并且具有抑郁症的行动学表现。该模型的建立为将来探讨黄褐斑动物模型提供了基础和思路，为研究黄褐斑治疗方法提供了较为理想的动物模型。
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[收稿日期]2012-12-05 [修回日期]2013-01-26
编辑/张惠娟