【摘 要】
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本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达,并与体外转染方法作比较.应用含B区缺失(760aa-1639aa)人F
【机 构】
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上海第二医科大学附属瑞金医院,上海市医学检验重点实验室
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本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达,并与体外转染方法作比较.应用含B区缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC-FⅧBD,ex vivo转染小鼠骨髓基质细胞,同时将pLNC-FⅧBD与PAMAM树枝状聚合物按照1:15混合以形成复合体PAMAM-pLNC-FⅧBD进行小鼠in vivo转染.分别于注射后第24,48小时,第1,2,3,4周取血,分离血浆,采用一期法测定人FⅧ活性(FⅧ c),ELISA法测定人FⅧ抗原(FⅧAg),并采用Bethesdainhibitor assay测定人FⅧ抗体;同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA,进行RT-PCR,观察各组织的转录,并用苏木素-伊红染色法观察各组织的形态学改变.结果表明,逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后,可以在体内继续表达人FⅧ,并且能有效地分泌至血液中.宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续3周以上,注射后第24小时表达最高水平,人FⅧAg平均为8.6 ng/ml,此后人FⅧ抗体逐渐生成,人FⅧAg水平渐低,于注射后第4周不再能测出人FⅧAg.注射复合体PAMAM-pLNC-F ⅧBD在体内转染后,获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平最高,人FⅧc和FⅧAg 的平均水平分别为0.62U/ml和115.5 ng/ml;注射后第3周平均水平降至0.042U/ml.RT-PCR结果表明,各脏器表达人FⅧ的水平不一,脾脏和肺脏表达水平高,且时间长,注射后各个时间点的小鼠血浆均未见人FⅧ抗体产生.组织病理学检查未发现小鼠各器官组织有病理改变.结论:经逆转录病毒介导的人FⅧ经ex vivo转染于BALB小鼠体内,其表达人FⅧ水平较低且该小鼠免疫原性增强,容易产生抗体;C57BL/6J小鼠在注射复合体PAMAM-pLNC-hFⅧBD(即体内转染)后可获得短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平最高,至少可持续表达2周以上.
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