论文部分内容阅读
[摘要] 目的：以南方红豆杉的枝叶为原料，研究其活性成分10一脱乙酰巴卡丁Ⅲ(10-DABⅢ)提取的最佳工艺条件。方法：运用正交试验法研究萃取温度、萃取压力、萃取时间、混合夹带剂用量对CO2超临界萃取10-DABⅢ的影响。结果：最佳工艺条件为：夹带剂用量为15ml，萃取温度为50℃，压力为25MPa，时间在180min。各因素影响的强烈程度为夹带剂用量＞萃取温度＞压力＞时间。用最佳工艺条件从南方红豆杉枝叶中提取10-DABⅢ的平均量为0.600g/kg。
[关键词] 10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ CO2超临界萃取 混合夹带剂 高效液相色谱
紫杉醇在红豆杉属[1]（Taxus breuifilia）植物树皮中含量仅为0.0029％～0.010％，且红豆杉是国家珍稀保护植物，生长缓慢，每提取1公斤要砍剥1000-2000棵树的树皮，按照目前的资源及需求，如果直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，不仅资源有限，而且不利于资源保护。
10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ（10-DAB III，分子式：C23H36O10，分子量为544.60）[2]是合成多烯紫杉醇的前体物质，存在于红豆杉的枝叶、树皮中，含量远高于紫杉醇，以10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ为原料，采用酶催化法半合成工艺来制备紫杉醇，可大大简化合成过程，使紫杉醇骨架修饰所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和生产率，进而为在更大规模上进行紫杉醇生产提供了技术支持，最终使紫杉醇化学合成(半合成)的产业化有实现的可能[3]。
超临界CO2萃取是当前世界新一代的化学分离技术，与以前的压榨法、溶剂浸提法、分子蒸馏法等技术比较，具有抽提效能佳，萃取温度低，能完全保留萃取物的天然属性和生理活性，无残留溶剂，无环境污染等优点，能够高效提取植物活性成份[4]。
南方红豆杉（Taxus chinensis(Pi1g)Rehd）是湖南省栽培较多的植物[5]，每年有大量落叶生成，资源十分丰富，但目前国内外关于从南方红豆杉中萃取10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ尚没有系统报道，本研究的目的是探讨从南方红豆杉落叶中萃取10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ的工艺条件，为南方红豆杉的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料与设备
1.1.1 实验设备
CO2超临界萃取设备：江苏飞宇公司；高效液相色谱：北京奥瑞公司。
1.1.2 实验试剂
甲醇：分析纯，天津化学制剂厂；乙醇：分析纯，天津化学制剂厂；乙晴：色谱纯，天津化学制剂厂；10-DAB：标准纯，中国标准物中心。
1.1.3 红豆杉
南方红豆杉，采于湖南新宁，3年生枝条。
1.2 实验方法
1.2.1工艺流程
南方红豆杉 → 鲜料净选 → 堆置自然发酵 → 干燥 → 粉碎→ CO2超临界萃取 → 提取液色谱分析 → 干燥
1.2.2操作方法
粉碎原料，20-28°C自然堆置，发酵5-7天，待原料由深绿色变成褐色细粉或小块，打开晾干，粉碎。
提取：采用CO2超临界萃取法，每次用料量200g，根据10-DAB Ⅲ具有极性的化学特性，参考国内外CO2超临界萃取紫杉醇以及溶剂法萃取10-DAB Ⅲ的提取技术[6]，为提高提取率，本研究加入甲醇/乙醇=2:1（体积比）做夹带剂，同时设定萃取所需的温度。选定温度、压力、时间、夹带剂用量等4个因素为主要考察对象，见表1。
分析：HPLC法分析，对比227nm下标准物和试验样品的出峰时间，确定样品中是否含有10-DABⅢ，并选定分析峰。根据同一物质峰面积与物质的量成正比的关系，根据标准曲线，计算不同萃取条件下的提取物含量，得出最佳工艺条件。
①分析条件
固定相：ODS.5ü.；柱温：60℃；流速：0.3ml/min；进样量：4 ml/min；流动相：H2O/乙晴=60：40；检测波长：227nm。
②标准液配备
精确称取5.00mg10—DABⅢ（标准样）加入5ml甲醇中，超声震荡促进溶解,配成1.000mg/ml母液，然后用甲醇按递度稀释法配成10ug/ml，20ug/ml，40ug/ml，50ug/ml标准溶液。
③标准曲线
吸取上述标准溶液各10μl，分别注入色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录色谱图及其峰面积数据。用归一法进行数据处理。
④ 样品检测方法
将各组提取液分别充分溶解到甲醇中，准确定容到250ml的容量瓶中。然后再分别取1ml定容到50ml容量瓶中，得到我们需要用来检测的待测样。
⑤含量计算:每g红豆杉中10-DABⅢ用下式计算含量：
2 结果与分析
2.1 正交试验的结果及分析
用二氧化碳超临界萃取法从南方红豆杉中提取10-DAB Ⅲ的正交试验结果见表2，对实验结果的方差分析见表3。
根据对表2的正交结果直观分析，可知最佳工艺条件为：D2C2B2A3，即夹带剂用量为15ml，萃取温度为50℃，压力为25MPa，时间在180min，在4个影响因子中，夹带剂用量对萃取产率的影响最大，温度、压力次之，时间因素影响力最低。由表3可知，方差分析的结果与直观分析一致。
2.2 各影响因子对提取率的影响
2.2.1 夹带剂用量对提取率的影响
10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ为强极性化合物，加入夹带剂（乙醇/甲醇）有利于提高其在CO2中的溶解性，降低二氧化碳超临界萃取的压力，提高萃取率，但在萃取物质中混杂的夹带剂会导致产物分离的成本增加。夹带剂用量过大时，会影响超临界CO2液体的溶解特性[6]。本研究的结果表明，夹带剂的用量为200g物料10ml、15ml、20ml时，各水平10—DABⅢ平均值分别为0.496、0.549、0.429，夹带剂的用量为15ml时萃取率最高（见图1）。
2.2.2 萃取温度对提取率的影响
温度是影响萃取率的重要因素。从表2可以看出，温度为40℃、50℃、60℃，各水平的平均值分别为0.503、0.517、0.454，萃取温度在40-50℃的范围内,萃取率随温度的升高而增加，超过50℃后，萃取率反而下降，可能的原因是温度增高，分子运动的速度加快，相互碰撞的机会增加，有利于提高物料的扩散系数，10-DABⅢ的提取率增加，另一方面，温度升高又降低了CO2的密度，从而导致溶解能力下降，对萃取不利[7]。实验结果显示40-50℃是可选取的温度范围，50℃时最佳（结果见图2）。
2.2.3 萃取压力对提取率的影响
萃取压力对超临界流体的相对体积质量、粘度和扩散系数的影响较大，压力的微小变化会对超临界流体的溶解特性有十分明显的影响[8]。从表2可以看出，压力为20MPa、25MPa、30MPa时，各水平的平均值分别为0.504、0.511、0.459，在20-25MPa范围内萃取率随压力的提高而增加，在25-30MPa范围时，萃取率随压力的提高而降低，最佳的萃取压力为25Mpa（见图3）。
2.2.4 萃取时间对提取率的影响
萃取时间的增加，有利于超临界流体及夹带剂与红豆杉枝叶中10—DABⅢ的溶解平衡，时间越长，萃取率越高。一般情况下，超临界流体CO2与溶质未能达到良好接触，萃取量较少，萃取时间达到某一水平时，超临界流体与10—DAB Ⅲ接近溶解平衡，再增加萃取时间，萃取率虽有增加，但增加量相对有限，本研究结果表明，萃取时间在120-180min时，随着萃取时间增加，萃取率也相应提高（见图4），考虑到10—DAB Ⅲ的价格，我们认为150-180min均是可以采用的提取时间，我们选用180min。
2.2.5 最佳工艺条件试验
按夹带剂用量为15ml,萃取温度为50℃，压力为25MPa，时间在180min的条件进行了3次平行试验，并按1.2.2相同的方法进行分析，结果见表4。
注：标样相对峰面积1277246，含量10.00ug/ml。
由表4可知: D2C2B2A3条件下10—DABⅢ得率高于表2各组试验的结果，说明在本实验条件下，D2C2B2A3的工艺条件是最佳的选择。
3 结论
CO2超临界—混合夹带剂法从南方红豆杉中提取10－DABⅢ的最佳工艺条件为：夹带剂用量为15ml，萃取温度为50℃，压力为25Mpa，萃取时间180min。各因素影响的强烈程度为：夹带剂用量＞萃取温度＞压力＞时间。在最佳工艺条件下从南方红豆杉枝叶中提取10－脱乙酰巴卡丁Ⅲ的平均量为0.600g/kg。
参考文献：
[1] 王晓清.现代中药生产新技术应用概况[J]. 中国中医药信息杂志, 2003,10 (7): 83-85.
[2] 陈冲.中药现代化研究[M]. 北京:科学出版社,2006：467-512.
[3] 杨陶,李明,陈建民.红豆杉中紫杉烷类化合物制备10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ[J]复旦大学学报(自然科学版),2004,(6):124-126.
[4] 郭章华.周敏华.超临界流体萃取技术在中药研究领域的应用[J]. 国际医药卫生导报,2003,9(2~3):32-33.
[5]《中国树木志》编写组.中国树木志[M].北京：中国林业出版社,1983：389.
[6] 李青松，李银保等. 超临界流体萃取江西信丰金盆山红豆杉枝叶中紫杉醇的研究[J].时珍国医国药,2008.(2)407-408.
[7] 王欣，李元瑞. 超临界流体萃取过程参数的优化选择[J].中国油脂, 2000, 25 (6):200-203.
[8] 杨俊兰，马一太等. 超临界压力下CO2液体的性质研究[J]. 流体机械，2008:（1）: 53-58.
[关键词] 10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ CO2超临界萃取 混合夹带剂 高效液相色谱
紫杉醇在红豆杉属[1]（Taxus breuifilia）植物树皮中含量仅为0.0029％～0.010％，且红豆杉是国家珍稀保护植物，生长缓慢，每提取1公斤要砍剥1000-2000棵树的树皮，按照目前的资源及需求，如果直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，不仅资源有限，而且不利于资源保护。
10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ（10-DAB III，分子式：C23H36O10，分子量为544.60）[2]是合成多烯紫杉醇的前体物质，存在于红豆杉的枝叶、树皮中，含量远高于紫杉醇，以10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ为原料，采用酶催化法半合成工艺来制备紫杉醇，可大大简化合成过程，使紫杉醇骨架修饰所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和生产率，进而为在更大规模上进行紫杉醇生产提供了技术支持，最终使紫杉醇化学合成(半合成)的产业化有实现的可能[3]。
超临界CO2萃取是当前世界新一代的化学分离技术，与以前的压榨法、溶剂浸提法、分子蒸馏法等技术比较，具有抽提效能佳，萃取温度低，能完全保留萃取物的天然属性和生理活性，无残留溶剂，无环境污染等优点，能够高效提取植物活性成份[4]。
南方红豆杉（Taxus chinensis(Pi1g)Rehd）是湖南省栽培较多的植物[5]，每年有大量落叶生成，资源十分丰富，但目前国内外关于从南方红豆杉中萃取10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ尚没有系统报道，本研究的目的是探讨从南方红豆杉落叶中萃取10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ的工艺条件，为南方红豆杉的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料与设备
1.1.1 实验设备
CO2超临界萃取设备：江苏飞宇公司；高效液相色谱：北京奥瑞公司。
1.1.2 实验试剂
甲醇：分析纯，天津化学制剂厂；乙醇：分析纯，天津化学制剂厂；乙晴：色谱纯，天津化学制剂厂；10-DAB：标准纯，中国标准物中心。
1.1.3 红豆杉
南方红豆杉，采于湖南新宁，3年生枝条。
1.2 实验方法
1.2.1工艺流程
南方红豆杉 → 鲜料净选 → 堆置自然发酵 → 干燥 → 粉碎→ CO2超临界萃取 → 提取液色谱分析 → 干燥
1.2.2操作方法
粉碎原料，20-28°C自然堆置，发酵5-7天，待原料由深绿色变成褐色细粉或小块，打开晾干，粉碎。
提取：采用CO2超临界萃取法，每次用料量200g，根据10-DAB Ⅲ具有极性的化学特性，参考国内外CO2超临界萃取紫杉醇以及溶剂法萃取10-DAB Ⅲ的提取技术[6]，为提高提取率，本研究加入甲醇/乙醇=2:1（体积比）做夹带剂，同时设定萃取所需的温度。选定温度、压力、时间、夹带剂用量等4个因素为主要考察对象，见表1。
分析：HPLC法分析，对比227nm下标准物和试验样品的出峰时间，确定样品中是否含有10-DABⅢ，并选定分析峰。根据同一物质峰面积与物质的量成正比的关系，根据标准曲线，计算不同萃取条件下的提取物含量，得出最佳工艺条件。
①分析条件
固定相：ODS.5ü.；柱温：60℃；流速：0.3ml/min；进样量：4 ml/min；流动相：H2O/乙晴=60：40；检测波长：227nm。
②标准液配备
精确称取5.00mg10—DABⅢ（标准样）加入5ml甲醇中，超声震荡促进溶解,配成1.000mg/ml母液，然后用甲醇按递度稀释法配成10ug/ml，20ug/ml，40ug/ml，50ug/ml标准溶液。
③标准曲线
吸取上述标准溶液各10μl，分别注入色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录色谱图及其峰面积数据。用归一法进行数据处理。
④ 样品检测方法
将各组提取液分别充分溶解到甲醇中，准确定容到250ml的容量瓶中。然后再分别取1ml定容到50ml容量瓶中，得到我们需要用来检测的待测样。
⑤含量计算:每g红豆杉中10-DABⅢ用下式计算含量：
2 结果与分析
2.1 正交试验的结果及分析
用二氧化碳超临界萃取法从南方红豆杉中提取10-DAB Ⅲ的正交试验结果见表2，对实验结果的方差分析见表3。
根据对表2的正交结果直观分析，可知最佳工艺条件为：D2C2B2A3，即夹带剂用量为15ml，萃取温度为50℃，压力为25MPa，时间在180min，在4个影响因子中，夹带剂用量对萃取产率的影响最大，温度、压力次之，时间因素影响力最低。由表3可知，方差分析的结果与直观分析一致。
2.2 各影响因子对提取率的影响
2.2.1 夹带剂用量对提取率的影响
10—脱乙酰巴卡丁Ⅲ为强极性化合物，加入夹带剂（乙醇/甲醇）有利于提高其在CO2中的溶解性，降低二氧化碳超临界萃取的压力，提高萃取率，但在萃取物质中混杂的夹带剂会导致产物分离的成本增加。夹带剂用量过大时，会影响超临界CO2液体的溶解特性[6]。本研究的结果表明，夹带剂的用量为200g物料10ml、15ml、20ml时，各水平10—DABⅢ平均值分别为0.496、0.549、0.429，夹带剂的用量为15ml时萃取率最高（见图1）。
2.2.2 萃取温度对提取率的影响
温度是影响萃取率的重要因素。从表2可以看出，温度为40℃、50℃、60℃，各水平的平均值分别为0.503、0.517、0.454，萃取温度在40-50℃的范围内,萃取率随温度的升高而增加，超过50℃后，萃取率反而下降，可能的原因是温度增高，分子运动的速度加快，相互碰撞的机会增加，有利于提高物料的扩散系数，10-DABⅢ的提取率增加，另一方面，温度升高又降低了CO2的密度，从而导致溶解能力下降，对萃取不利[7]。实验结果显示40-50℃是可选取的温度范围，50℃时最佳（结果见图2）。
2.2.3 萃取压力对提取率的影响
萃取压力对超临界流体的相对体积质量、粘度和扩散系数的影响较大，压力的微小变化会对超临界流体的溶解特性有十分明显的影响[8]。从表2可以看出，压力为20MPa、25MPa、30MPa时，各水平的平均值分别为0.504、0.511、0.459，在20-25MPa范围内萃取率随压力的提高而增加，在25-30MPa范围时，萃取率随压力的提高而降低，最佳的萃取压力为25Mpa（见图3）。
2.2.4 萃取时间对提取率的影响
萃取时间的增加，有利于超临界流体及夹带剂与红豆杉枝叶中10—DABⅢ的溶解平衡，时间越长，萃取率越高。一般情况下，超临界流体CO2与溶质未能达到良好接触，萃取量较少，萃取时间达到某一水平时，超临界流体与10—DAB Ⅲ接近溶解平衡，再增加萃取时间，萃取率虽有增加，但增加量相对有限，本研究结果表明，萃取时间在120-180min时，随着萃取时间增加，萃取率也相应提高（见图4），考虑到10—DAB Ⅲ的价格，我们认为150-180min均是可以采用的提取时间，我们选用180min。
2.2.5 最佳工艺条件试验
按夹带剂用量为15ml,萃取温度为50℃，压力为25MPa，时间在180min的条件进行了3次平行试验，并按1.2.2相同的方法进行分析，结果见表4。
注：标样相对峰面积1277246，含量10.00ug/ml。
由表4可知: D2C2B2A3条件下10—DABⅢ得率高于表2各组试验的结果，说明在本实验条件下，D2C2B2A3的工艺条件是最佳的选择。
3 结论
CO2超临界—混合夹带剂法从南方红豆杉中提取10－DABⅢ的最佳工艺条件为：夹带剂用量为15ml，萃取温度为50℃，压力为25Mpa，萃取时间180min。各因素影响的强烈程度为：夹带剂用量＞萃取温度＞压力＞时间。在最佳工艺条件下从南方红豆杉枝叶中提取10－脱乙酰巴卡丁Ⅲ的平均量为0.600g/kg。
参考文献：
[1] 王晓清.现代中药生产新技术应用概况[J]. 中国中医药信息杂志, 2003,10 (7): 83-85.
[2] 陈冲.中药现代化研究[M]. 北京:科学出版社,2006：467-512.
[3] 杨陶,李明,陈建民.红豆杉中紫杉烷类化合物制备10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ[J]复旦大学学报(自然科学版),2004,(6):124-126.
[4] 郭章华.周敏华.超临界流体萃取技术在中药研究领域的应用[J]. 国际医药卫生导报,2003,9(2~3):32-33.
[5]《中国树木志》编写组.中国树木志[M].北京：中国林业出版社,1983：389.
[6] 李青松，李银保等. 超临界流体萃取江西信丰金盆山红豆杉枝叶中紫杉醇的研究[J].时珍国医国药,2008.(2)407-408.
[7] 王欣，李元瑞. 超临界流体萃取过程参数的优化选择[J].中国油脂, 2000, 25 (6):200-203.
[8] 杨俊兰，马一太等. 超临界压力下CO2液体的性质研究[J]. 流体机械，2008:（1）: 53-58.