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目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克隆数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性。实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态。方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成。①材料:清洁级孕13.5d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供;kryo-550-16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成。②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞。程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃~-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃~-30℃,每分钟降温0.3℃→-30℃~-150℃,每分钟降温10℃。降至-150℃时置液氮中保存。改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎干细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存。传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存。③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度。鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性。结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81~13.89,P<0.01)。②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P<0.05;t=6.89,P<0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P<0.01;x2=9.69,P<0.01)。③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1-81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%。结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性。②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的。