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摘要：
目的：建立新生化颗粒中羟基红花黄色素A含量测定的方法。方法：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；以甲醇-乙腈-0.7%的磷酸溶液（26：2：72）为流动相；流速1.0mL/min；检测波长403nm；柱温30℃。结果：羟基红花黄色素A质量浓度在8.3～132.8μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.9996），加样回收率为99.11%，RSD为0.96%（n=6）；结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于新生化颗粒中羟基红花黄色素A的含量测定。
关键词：羟基红花黄色素A；新生化颗粒；高效液相色谱法
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0048-01
新生化颗粒由当归、川芎、桃仁、益母草、红花、炙甘草、干姜7味中药组成，具有活血、去淤、止痛的功效。本方中的红花是活血通经、去淤止痛的主药，而羟基红花黄色素A是红花的主要功效成分。笔者采用高效液相色谱法测定该成分的含量[1-3]，以为进一步完善该制剂的质量控制标准提供依据。
1 仪器与试药
1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Sartorius-ME235S电子天平；CQ250超声清洗器。羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检定所，批号111637-201207，供含量测定用，含量100.0%）；新生化颗粒（云南白药集团股份有限公司，批号分别为ZLB1304， ZLB1201，，ZLB1308）。乙腈为色谱纯（经0.45μm滤膜过滤），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18；流动相：甲醇-乙腈-0.7%的磷酸溶液（26：2：72）；进样量：10μL；流速1.0mL/min；检测波长403nm；柱温30℃。
2.2 溶液制备：
供试品溶液制备：取本品，研细，精密称取约2.0g，置锥形瓶中，精密加入25%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率50kHz）40分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1ml含0.13mg的溶液，即得。阴性对照溶液制备：按新生化颗粒剂制备工艺，制备缺红花的阴性样品，照供品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.3 方法学考察：
专属性试验 分别精密吸取2.2项下3种溶液各10μL，按拟定的色谱条件进样，记录色谱图，在此条件下，理论塔板数以羟基红花黄色素A峰计算大于3000。见图1。可见，在对照品溶液色谱主峰处，供试品溶液色谱相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无此色谱峰，说明处方中其他成分对测定无干扰。
图1 高效液相色谱图 （1）阴性对照溶液 （2）对照品溶液 （3）供试品溶液
线性关系考察 密称取羟基红花黄色素A对照品16.60mg，25%的甲醇溶液定容于100 mL容量瓶中，得质量浓度为166μg/ml作为母液，分别精密吸取母液0.5；1.0；2.0；4.0；8.0ml；分别定容于10ml的容量瓶中，得质量浓度分别为8.3；16.6；33.2；66.4；132.8μg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液，分别取上述溶液10μl注入液相色谱仪，以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，得回归方程为：y=242.90x+128.71，r=0.9996，表明羟基红花黄色素A质量浓度在8.3～132.8μg/ml范围内线性关系良好。
精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10μl，重复进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.98%（n=6）。
稳定性试验：取同一供试品溶液，于制备后0，2，4，8，12，24小时分别进样10μL，记录峰面积，结果RSD为0.54%、（n=6）。
重复性试验：取同一批号样品（批号为ZLB1304），依法平行制备6份供试品溶液，依法测定含量，结果RSD为1.13%、（n=6）。
加样回收试验：取样品（批号ZLB1304）6份，精密加入羟基红花黄色素A对照品（浓度为0.1328mg/ml）适量，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定，计算回收率，结果羟基红花黄色素A平均回收率为 99.11%，RSD为0.96%；结果见表1.
表1 羟基红花黄色素A加样回收实验结果（n=6）
2.4 样品测定：
取样品3批，按拟定色谱条件操作，测定含量，结果批号为ZLB1304，ZLB1201，ZLB1308的3批样品中羟基红花黄色素A的含量分别为1.846，2.035，1.948mg/g。
3 讨论
曾试用水、25%甲醇、甲醇、乙醇提取，结果发现，用25%甲醇作为提取溶剂效果最优。实验中考察了超声5、l0、20、40、60、100分钟不同提取时间对提取效率的影响，结果表明超声40分钟后供试品中羟基红花黄色素A的含量基本稳定不变，故将提取时间定为超声40分钟。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）（第141-142页）[M].中国医药科技出版，2010.
[2]何珊珊，万军，谭睿，高效液相色谱法测定肺热普清散中羟基红花黄色素A含量，[J]中国药业，2013，22（19）：29-30
[3]刘进怀，张晴，薛彬，等.HPLC测定降糖明目颗粒中羟基红花黄色素A的含量，[J]中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：48
目的：建立新生化颗粒中羟基红花黄色素A含量测定的方法。方法：色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；以甲醇-乙腈-0.7%的磷酸溶液（26：2：72）为流动相；流速1.0mL/min；检测波长403nm；柱温30℃。结果：羟基红花黄色素A质量浓度在8.3～132.8μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.9996），加样回收率为99.11%，RSD为0.96%（n=6）；结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于新生化颗粒中羟基红花黄色素A的含量测定。
关键词：羟基红花黄色素A；新生化颗粒；高效液相色谱法
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）08-0048-01
新生化颗粒由当归、川芎、桃仁、益母草、红花、炙甘草、干姜7味中药组成，具有活血、去淤、止痛的功效。本方中的红花是活血通经、去淤止痛的主药，而羟基红花黄色素A是红花的主要功效成分。笔者采用高效液相色谱法测定该成分的含量[1-3]，以为进一步完善该制剂的质量控制标准提供依据。
1 仪器与试药
1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Sartorius-ME235S电子天平；CQ250超声清洗器。羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检定所，批号111637-201207，供含量测定用，含量100.0%）；新生化颗粒（云南白药集团股份有限公司，批号分别为ZLB1304， ZLB1201，，ZLB1308）。乙腈为色谱纯（经0.45μm滤膜过滤），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18；流动相：甲醇-乙腈-0.7%的磷酸溶液（26：2：72）；进样量：10μL；流速1.0mL/min；检测波长403nm；柱温30℃。
2.2 溶液制备：
供试品溶液制备：取本品，研细，精密称取约2.0g，置锥形瓶中，精密加入25%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率50kHz）40分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液制备：取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1ml含0.13mg的溶液，即得。阴性对照溶液制备：按新生化颗粒剂制备工艺，制备缺红花的阴性样品，照供品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.3 方法学考察：
专属性试验 分别精密吸取2.2项下3种溶液各10μL，按拟定的色谱条件进样，记录色谱图，在此条件下，理论塔板数以羟基红花黄色素A峰计算大于3000。见图1。可见，在对照品溶液色谱主峰处，供试品溶液色谱相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无此色谱峰，说明处方中其他成分对测定无干扰。
图1 高效液相色谱图 （1）阴性对照溶液 （2）对照品溶液 （3）供试品溶液
线性关系考察 密称取羟基红花黄色素A对照品16.60mg，25%的甲醇溶液定容于100 mL容量瓶中，得质量浓度为166μg/ml作为母液，分别精密吸取母液0.5；1.0；2.0；4.0；8.0ml；分别定容于10ml的容量瓶中，得质量浓度分别为8.3；16.6；33.2；66.4；132.8μg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液，分别取上述溶液10μl注入液相色谱仪，以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，得回归方程为：y=242.90x+128.71，r=0.9996，表明羟基红花黄色素A质量浓度在8.3～132.8μg/ml范围内线性关系良好。
精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10μl，重复进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.98%（n=6）。
稳定性试验：取同一供试品溶液，于制备后0，2，4，8，12，24小时分别进样10μL，记录峰面积，结果RSD为0.54%、（n=6）。
重复性试验：取同一批号样品（批号为ZLB1304），依法平行制备6份供试品溶液，依法测定含量，结果RSD为1.13%、（n=6）。
加样回收试验：取样品（批号ZLB1304）6份，精密加入羟基红花黄色素A对照品（浓度为0.1328mg/ml）适量，按供试品溶液制备方法制备溶液并依法测定，计算回收率，结果羟基红花黄色素A平均回收率为 99.11%，RSD为0.96%；结果见表1.
表1 羟基红花黄色素A加样回收实验结果（n=6）
2.4 样品测定：
取样品3批，按拟定色谱条件操作，测定含量，结果批号为ZLB1304，ZLB1201，ZLB1308的3批样品中羟基红花黄色素A的含量分别为1.846，2.035，1.948mg/g。
3 讨论
曾试用水、25%甲醇、甲醇、乙醇提取，结果发现，用25%甲醇作为提取溶剂效果最优。实验中考察了超声5、l0、20、40、60、100分钟不同提取时间对提取效率的影响，结果表明超声40分钟后供试品中羟基红花黄色素A的含量基本稳定不变，故将提取时间定为超声40分钟。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）（第141-142页）[M].中国医药科技出版，2010.
[2]何珊珊，万军，谭睿，高效液相色谱法测定肺热普清散中羟基红花黄色素A含量，[J]中国药业，2013，22（19）：29-30
[3]刘进怀，张晴，薛彬，等.HPLC测定降糖明目颗粒中羟基红花黄色素A的含量，[J]中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：48