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摘 要：利用Illumina平臺Miseq高通量测序技术对烟草根际土壤细菌进行高通量测序，结合相关生物信息学分析，探讨了常规施肥、腐殖酸型有机无机复混肥、腐殖酸型生物有机肥和-N 20%腐殖酸型生物有机肥4种处理在烟草团棵期和采收期根际土壤细菌群落组成、多样性和结构的变化。结果显示，烟草根际土壤中细菌优势门（相对丰度>10%）为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）;团棵期和采收期各处理的ACE指数和Chao1指数较CK均有所增加，说明施肥可以提高土壤细菌群落丰富性，其中采摘期施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥处理的ACE指数显著高于CK;分层聚类图在属的水平上显示，不同施肥处理的连作植烟土壤细菌群落存在较大差异，但这种差异不体现在结构多样性上。Heatmap图分析结果表明，土壤pH、有机质、养分等对烟草土壤细菌群落组成和多样性存在影响。施用常规肥和-N 20%腐殖酸型生物有机肥对烟草土壤细菌优势类群的相对丰度及群落结构的影响大于施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥，但施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥可以提高土壤细菌的多样性。
关键词：烤烟;腐殖酸型生物有机肥;高通量测序;土壤细菌群落
中图分类号 S147.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0029-07
Abstract： This paper aimed to study the tobacco soil bacteria of different fertilizer application， the influence of structure and diversity， the deepening understanding of tobacco soil microbial groups and the community structure changes.The technology of high-throughput sequencing on Illumina MiSeq platform was adopted to investigate the effects of different fertilization on bacterial communities in tobacco rhizospheric soil. The 16S rDNA genes of
topsoil bacteria in tobacco rhizospheric soils were sequenced by high-throughput sequencing on Illumina MiSeq1 platform and related biological analysis conducted to investigate the changes in soil bacterial composition，diversity and structure under 4 different fertilization at resetting growth stage and picking period.Proteobacteria， Chloroflexi， Acidobacteria were the dominant phyla （with relative abundance>10%） in tobacco rhizospheric soils. The richness indexes （Chaol and ACE indexes） were higher for each treatment than for CK at resetting growth stage and picking period， showed that fertilization can improve soil bacterial community richness; The richness indexes （ACE indexes） were significantly higher for T2 and T3 than for CK in picking period， showed that application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve soil bacterial community richness. Hierarchical cluster analysis showed that different fertilizer treatments differ from that of continuous cropping plant tobacco soil bacterial community， but the difference is not reflected on the structural diversity. Heatmap figure analysis results show that the soil pH， organic matter and nutrient have correlation with tobacco soil bacterial community composition and diversity.The conventional fertilization and -N 20% humic acid biological organic fertilizer on tobacco soil bacteria dominant relative abundance and community structure is greater than the effect of applying humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer， but the application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve the diversity of soil bacteria. Key words： Flue-cured tobacco; Humic acid biological organic fertilizer; High-throughput sequencing; Bacterial community
烟草（Nicotiana tabacum）属于茄科（Solanaceae）旱地作物。作为土壤肥力状况的重要指标的土壤微生物，对其群落结构和功能的研究一直是热点。烟草土壤微生物尤其是土壤细菌群落结构变化对烟草的品质有着重要的影响[1]。目前对烟草周围环境微生物的研究主要集中在内生菌，探索其抗菌及促生作用[2-5]，对土壤微生物尤其是细菌群落结构的研究还为数不多。
传统培养技术所获得的可培养微生物只占土壤微生物总数的1%左右[6]，随着科学技术的不断进步，DGGE等传统分子生物学方法的局限性日益凸显。近年来，第2代高通量测序技术为土壤微生物等领域提供了支持，得到了广泛应用[7]。
施用化肥及有机肥会对农田土壤微生物群落结构及多样性产生一定的影响。由于肥料施用方式（施用量、长期施用或短期施用）、土壤类型和利用方式等因素的影响， 使得施肥对土壤微生物多样性的影响非常复杂， 这一问题的相关报道结论不同，相关研究还有待进一步深入探讨。笔者应用Illumina平台的Miseq高通量测序烟草土壤细菌16s rDNA，研究了不同肥料的施用对烟草土壤细菌组成、结构及多样性的影响，可以加深對烟草土壤微生物类群和群落结构变化的认识，为改良烟草肥料提供基础理论支持，并为提高烟草产量及品质提供研究思路。
1 材料与方法
1.1 试验区概况 试验在福建省三明市泰宁县朱口镇音山村（117°13′35′′E，26°56′51′′N），平均海拔300m，年平均气温为18.5℃，年日照时数1506h，全年无霜期为216～225d，年平均降雨量为1786mm。试验地为水稻轮作的烟田，供试土壤类型为砂壤土，种植烤烟前耕层土壤（0～20cm）基本化学性质：pH5.9，有机质35g/kg，碱解氮174mg/kg，有效磷39.8mg/kg，速效钾227mg/kg。供试烤烟品种为翠碧1号，由福建省烟草公司提供。烤烟大田株行距1.2m×0.5m，密度16675株/hm2，移栽时间2015年1月29日，6月上旬开始分批分部位采收。
1.2 试验设计 设5个处理，即常规施肥（T1，956kg/hm2）、腐殖酸型有机无机复混肥（T2，1006kg/hm2）、腐殖酸型生物有机肥（T3，1210kg/hm2），以及-N20%腐殖酸型生物有机肥（T4，805kg/hm2），CK为不施肥。每个处理3次重复，随机区组排列。T1中的肥料是烟草公司提供的烟草专用复合肥，成分比例为N：P2O5：K2O=10：7：21;T2腐殖酸型有机无机复混肥由贵州省贵福生态肥业有限公司提供，成分比例为N︰P2O5︰K2O=9.5︰6.3︰21.3;T3腐殖酸型生物有机肥来自贵州省贵福生态肥业有限公司，其有效菌种为枯芽孢杆菌（Bacillus subtilis），有效活菌数≥0.47亿/g，N︰P2O5︰K2O=7.9︰6.1︰22。各处理所用肥料结合整地，于2015年1月18日移栽时作为基肥施入，基肥追肥比为3︰1，小区面积334m2，其余操作同常规优质烤烟栽培技术规范。
1.3 样品采集 分别于团棵期和采收期取样，每个小区“S”形多点取样，在近烟株根部10cm处打土钻（直径3cm，深度15cm）作为1个耕层土壤样品，充分混匀，重复3次，每份土样分为2份，1份100g放入无菌袋中并迅速放入干冰盒中，带回实验室放入-80℃超低温冰箱中保存，另1份约200g用来分析土壤化学性质。共得到5个处理不同时期土壤样品30份，供高通量测序研究。
1.4 测定方法 土壤理化性质测定采用常规分析的方法[8]。使用MOBIO公司的试剂盒提取土壤DNA（PowerSoil? DNA Isolation Kit），按说明书操作，获得纯化的DNA后对细菌的16s rRNA基因V3～V4区进行高通量测序，委托上海美吉生物公司应用Illumina平台的MiSeq进行。
1.5 数据分析方法 Miseq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）13成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向。过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的read;根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接（merge）成1条序列，最小overlap长度为10bp;拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列;根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列。按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。
1.6 土壤样品测序、取样深度验证 由表1可知，通过对细菌16s rDNA的V3～V4区进行测序过滤，9个样品获得有效序列数在48889～57879，OTUs数在4392～5277，在97%相似水平下聚类为用于物种分类的OTU，统计得到各个样品在不同OTU中的丰度信息。标准化后的序列数大于10000条，说明测序效果很好，满足后续基因多样性及丰度等功能分析。 表1 各样品reads数及OTUs数
[处理 原始序列数 原始OTUs数 标准化后的序列数 标准化后的OTUs数 CK 54492 5277 42212 4112 RT1 48889 4510 42212 4341 RT2 57879 4803 42212 4225 RT3 50243 4563 42212 4306 RT4 52286 4392 42212 4183 PT1 48935 4514 42212 4325 PT2 56752 4581 42212 4400 PT3 54492 4515 42212 4343 PT4 52872 4456 42212 4128 ]
注：CK：移摘前土壤;T1：常规施肥;T2：腐殖酸型有机无机复混肥;T3：腐殖酸型生物有机肥;T4：-N20%腐殖酸型生物有机肥。R：团棵期;P：采收期。下同。
稀释曲线[9]是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefaction curve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样本的测序深度情况。试验所有样品在相似度0.97条件下的稀释曲线如图1所示，曲线趋向平坦，测序量均达到10000条以上，可以满足分析要求。
2 结果与分析
2.1 各土壤样品细菌群落的丰富度和多样性 Chao1指数和ACE指数反映细菌群落丰富度，其值越高表明群落物种的丰富度越高[10-11];Shannon指数反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性程度越高;Simpson指数反映了物种的优势度[10-12]。由表2可以看出，物种覆盖率为0.969～0.971，团棵期和采收期各处理的ACE指数和Chao1指数较CK均有所增加，说明施肥可以提高土壤细菌群落丰富性，其中采摘期处理2和处理3的ACE指数显著高于CK，说明施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥有助于提高土壤细菌群落丰富度。Simpson指数和Shannon指数变化范围都很小。试验结果表明施肥处理对土壤细菌群落丰富度存在一定影响，且在烟草不同生育期表现存在差异。
2.2 不同施肥处理土壤细菌类群 为了直观展示多样品间OTUs情况，用在属的水平相对丰度排名前50的细菌属进行双向二维聚类（图2），通过颜色的梯度及相似程度来反映数据的相似性和差异性，可以清楚获知样本间发生的变化。由图2可以看出，9个土壤样品分成2大类，RT3单独为一类，CK和其他处理为一类，其中同一时期的处理土壤样品细菌群落结构较相似，团棵期3个处理相似度较高，采收期处理两两聚类，相似度高。说明不同时期处理所含OTUs含量和种类差异较大。
对所有土壤样品测得的OTUs所对应的生物分类学信息进行统计表明，主要包括硝化螺旋菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单孢菌门、变形菌门，这5个门在各样品中所占比例均达4%以上，是植烟土壤中的优势菌门，图2中reads数前80的OTUs除以上5个菌门外，还分布于放线菌门。
在门的分类水平上，细菌分布在14个已知细菌门。如图3和图4所示，有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单孢菌门（Gemmatimonadetes）、绿菌门（Chlorobi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）、Latescibacteria、Parcubacteria和Saccharibacteria14个细菌门，相对丰度之和在各个处理土壤样品中均占到土壤细菌总量的95%以上。烟草CK和各处理在团棵期和采收期的优势细菌门均为变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门。在团棵期，T1处理的变形菌门相对丰度减少3.6%，绿弯菌门和酸杆菌门分别增加6%和2.8%，T4处理的绿弯菌门相对丰度增加4%，T2和T3处理变形菌门的相对丰度分别增加2.3%和2.8%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少;采收期，T1处理的变形菌门相对丰度增加2.9%，绿弯菌门和酸杆菌门分别减少0.7%和2.1%，T4处理的变形菌门相对丰度增加3%，酸杆菌门减少1.6%，T2和T3处理变形菌门的相对丰度分别增加4.2%和2.6%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少，在生育期变化趋势较一致。
通过Venn图（图5）分析了不同生育期土壤细菌共有的属的数量及特有的属，共有7210个属，均有分布的属有5290个：团棵期属的种类最多，为6935个;CK处理中属的种类最少，为5486个。CK中独有的属有21个，团棵期和成熟期分别有147个和229个。可见，使用肥料后随着生育期的推进可增加特有物种。
2.3 不同施肥处理的主成分 主坐标轴PC1可解释全部土壤样品细菌群落丰度和多样性方差的22.22%，主坐标轴PC2可解释全部土壤样品细菌群落的13.17%，两者累计可解释全部样品的35.39%（图6）[12]。样品多样性组成越相似，在PCA图中代表样品点间距离越近，CK和团棵期的各处理分散度较低，说明土壤样品性质相似，成熟期各处理较分散，說明土壤样品性质存在一定差异[13]。
2.4 不同施肥处理土壤细菌类群与土壤环境因子相关性 酸杆菌科的相对丰度与土壤pH呈正相关，经图3和图4分析常规施肥处理的酸杆菌门相对丰度增加2.8%，采收期减少2.1%，通过Heatmap图分析可知，酸杆菌科的相对丰度与施肥造成土壤pH的变化相关（图7）。丛毛单孢菌科、黄色杆菌科和芽单孢菌科同属于变形菌门，分别与TP、TN、AK正相关，说明土壤中NP含量、K的利用程度与优势菌门变形菌门的相对丰度变化相关。亚硝化单孢菌科与土壤pH呈负相关;浮霉菌科与TP负相关，黄单孢杆菌科与SOM呈正相关，与TN负相关;鞘酯菌科与TP、AP、AK均呈正相关。 3 结论与讨论
长期有机无机肥配施能够培肥地力[14]，而施用微生物菌肥可以将土壤微生态环境由紊乱复原到健康水平，从而起到防治土传病害的作用[15]。土壤微生物多样性相对比较稳定，长期合理施肥可以对土壤微生物群落结构和多样性产生一定的影響[16]，但短期施肥对土壤微生物的影响不显著[17]。本研究结果表明，不同施肥处理和不同生育期土壤细菌群落在结构上的差异不明显，而细菌群落的相对丰度存在差异，说明施肥造成了某些细菌类群的富集或衰减，而没有改变细菌群落种类，施肥等条件只影响了某些细菌种群的丰度。
植物根际细菌作为一类重要的微生物，与植物的生长发育有着密切的关系[19-21]。烟草种植土壤中细菌类群丰富，优势细菌门有变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门，其中变形菌门的相对丰度最大，为29.2%～35.8%。施用不同肥料改变了烟草种植土壤的理化性质，因此对土壤中细菌优势类群的相当丰度产生一定的影响。齐虹凌等[21]对不同菌群的相对丰度变化研究发现，细菌群落在烤烟生长的早期数量变化较大，而随着生育期的推进细菌群落相对丰度变化不明显。本研究中常规施肥的土壤在团棵期，变形菌门的相对丰度减少3.6%，采收期增加了2.9%;团棵期绿弯菌门和酸杆菌门分别增加6%和2.8%，采收期分别减少0.7%和2.1%，酸杆菌为嗜酸菌在土壤中分布广泛，酸杆菌门的相对丰度在不同生育期的变化与施肥后土壤pH变化有关;施用减氮20%腐殖酸型生物有机肥的土壤，在团棵期绿弯菌门的相对丰度增加4%，采收期变形菌门相对丰度增加3%，酸杆菌门减少1.6%，这与王培雯等[22]土壤脲酶与土壤细菌群落丰度和多样性均呈现反相关，单一的氮素水平增加不利于土壤细菌群落结构变化的研究结果基本一致。施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥的土壤变形菌门的相对丰度分别增加2.3%和2.8%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少;采收期，施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥的土壤变形菌门的相对丰度分别增加4.2%和2.6%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少，在生育期变化趋势较一致。本研究中施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥在烟草不同生育期对土壤优势菌门的相对丰度影响趋于稳定，说明这2种肥料对土壤细菌群落的影响是一个长期的相对稳定的变化过程，肥料中营养元素的配比对土壤细菌群落也有一定的影响。
Liu等[23-24]的研究表明土壤理化性质，尤其是土壤pH和土壤有机质对土壤细菌群落组成和多样性有显著影响。本研究中酸杆菌科的相对丰度与土壤pH呈正相关，这与不同生育期酸杆菌科的相对丰度和土壤pH的变化相吻合，由此可知酸杆菌科的相对丰度与施肥造成土壤pH的变化相关，印证了Liu等[23]的研究结果。变形菌门为细菌中最大的1个门，其中不乏土壤有益菌群，丛毛单孢菌科、黄色杆菌科和芽单孢菌科同属于变形菌门，其相对丰度分别与土壤全氮、全磷、速效钾呈正相关，说明优势菌门变形菌门的相对丰度变化与土壤中全磷、速效钾含量相关。亚硝化单孢菌科、芽单孢菌科的相对丰度与土壤pH呈负相关;浮霉菌科的相对丰度与全磷呈负相关，黄单孢杆菌科的相对丰度与土壤有机质呈正相关，与全氮呈负相关;鞘酯菌科的相对丰度与土壤全磷、速效磷、速效钾均呈正相关。
施用不同肥料对烟草土壤细菌优势类群的相对丰度及群落结构的影响不尽相同，施用常规施肥和-N20%腐殖酸型生物有机肥对烟草土壤细菌优势类群的相对丰度及群落结构的影响大于施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥，施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥在烟草不同生育期对土壤优势菌门的相对丰度影响趋于一致，但施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥可以提高土壤细菌的多样性。
参考文献
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（责编：徐世红）
关键词：烤烟;腐殖酸型生物有机肥;高通量测序;土壤细菌群落
中图分类号 S147.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0029-07
Abstract： This paper aimed to study the tobacco soil bacteria of different fertilizer application， the influence of structure and diversity， the deepening understanding of tobacco soil microbial groups and the community structure changes.The technology of high-throughput sequencing on Illumina MiSeq platform was adopted to investigate the effects of different fertilization on bacterial communities in tobacco rhizospheric soil. The 16S rDNA genes of
topsoil bacteria in tobacco rhizospheric soils were sequenced by high-throughput sequencing on Illumina MiSeq1 platform and related biological analysis conducted to investigate the changes in soil bacterial composition，diversity and structure under 4 different fertilization at resetting growth stage and picking period.Proteobacteria， Chloroflexi， Acidobacteria were the dominant phyla （with relative abundance>10%） in tobacco rhizospheric soils. The richness indexes （Chaol and ACE indexes） were higher for each treatment than for CK at resetting growth stage and picking period， showed that fertilization can improve soil bacterial community richness; The richness indexes （ACE indexes） were significantly higher for T2 and T3 than for CK in picking period， showed that application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve soil bacterial community richness. Hierarchical cluster analysis showed that different fertilizer treatments differ from that of continuous cropping plant tobacco soil bacterial community， but the difference is not reflected on the structural diversity. Heatmap figure analysis results show that the soil pH， organic matter and nutrient have correlation with tobacco soil bacterial community composition and diversity.The conventional fertilization and -N 20% humic acid biological organic fertilizer on tobacco soil bacteria dominant relative abundance and community structure is greater than the effect of applying humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer， but the application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve the diversity of soil bacteria. Key words： Flue-cured tobacco; Humic acid biological organic fertilizer; High-throughput sequencing; Bacterial community
烟草（Nicotiana tabacum）属于茄科（Solanaceae）旱地作物。作为土壤肥力状况的重要指标的土壤微生物，对其群落结构和功能的研究一直是热点。烟草土壤微生物尤其是土壤细菌群落结构变化对烟草的品质有着重要的影响[1]。目前对烟草周围环境微生物的研究主要集中在内生菌，探索其抗菌及促生作用[2-5]，对土壤微生物尤其是细菌群落结构的研究还为数不多。
传统培养技术所获得的可培养微生物只占土壤微生物总数的1%左右[6]，随着科学技术的不断进步，DGGE等传统分子生物学方法的局限性日益凸显。近年来，第2代高通量测序技术为土壤微生物等领域提供了支持，得到了广泛应用[7]。
施用化肥及有机肥会对农田土壤微生物群落结构及多样性产生一定的影响。由于肥料施用方式（施用量、长期施用或短期施用）、土壤类型和利用方式等因素的影响， 使得施肥对土壤微生物多样性的影响非常复杂， 这一问题的相关报道结论不同，相关研究还有待进一步深入探讨。笔者应用Illumina平台的Miseq高通量测序烟草土壤细菌16s rDNA，研究了不同肥料的施用对烟草土壤细菌组成、结构及多样性的影响，可以加深對烟草土壤微生物类群和群落结构变化的认识，为改良烟草肥料提供基础理论支持，并为提高烟草产量及品质提供研究思路。
1 材料与方法
1.1 试验区概况 试验在福建省三明市泰宁县朱口镇音山村（117°13′35′′E，26°56′51′′N），平均海拔300m，年平均气温为18.5℃，年日照时数1506h，全年无霜期为216～225d，年平均降雨量为1786mm。试验地为水稻轮作的烟田，供试土壤类型为砂壤土，种植烤烟前耕层土壤（0～20cm）基本化学性质：pH5.9，有机质35g/kg，碱解氮174mg/kg，有效磷39.8mg/kg，速效钾227mg/kg。供试烤烟品种为翠碧1号，由福建省烟草公司提供。烤烟大田株行距1.2m×0.5m，密度16675株/hm2，移栽时间2015年1月29日，6月上旬开始分批分部位采收。
1.2 试验设计 设5个处理，即常规施肥（T1，956kg/hm2）、腐殖酸型有机无机复混肥（T2，1006kg/hm2）、腐殖酸型生物有机肥（T3，1210kg/hm2），以及-N20%腐殖酸型生物有机肥（T4，805kg/hm2），CK为不施肥。每个处理3次重复，随机区组排列。T1中的肥料是烟草公司提供的烟草专用复合肥，成分比例为N：P2O5：K2O=10：7：21;T2腐殖酸型有机无机复混肥由贵州省贵福生态肥业有限公司提供，成分比例为N︰P2O5︰K2O=9.5︰6.3︰21.3;T3腐殖酸型生物有机肥来自贵州省贵福生态肥业有限公司，其有效菌种为枯芽孢杆菌（Bacillus subtilis），有效活菌数≥0.47亿/g，N︰P2O5︰K2O=7.9︰6.1︰22。各处理所用肥料结合整地，于2015年1月18日移栽时作为基肥施入，基肥追肥比为3︰1，小区面积334m2，其余操作同常规优质烤烟栽培技术规范。
1.3 样品采集 分别于团棵期和采收期取样，每个小区“S”形多点取样，在近烟株根部10cm处打土钻（直径3cm，深度15cm）作为1个耕层土壤样品，充分混匀，重复3次，每份土样分为2份，1份100g放入无菌袋中并迅速放入干冰盒中，带回实验室放入-80℃超低温冰箱中保存，另1份约200g用来分析土壤化学性质。共得到5个处理不同时期土壤样品30份，供高通量测序研究。
1.4 测定方法 土壤理化性质测定采用常规分析的方法[8]。使用MOBIO公司的试剂盒提取土壤DNA（PowerSoil? DNA Isolation Kit），按说明书操作，获得纯化的DNA后对细菌的16s rRNA基因V3～V4区进行高通量测序，委托上海美吉生物公司应用Illumina平台的MiSeq进行。
1.5 数据分析方法 Miseq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）13成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向。过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的read;根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接（merge）成1条序列，最小overlap长度为10bp;拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列;根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列。按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。
1.6 土壤样品测序、取样深度验证 由表1可知，通过对细菌16s rDNA的V3～V4区进行测序过滤，9个样品获得有效序列数在48889～57879，OTUs数在4392～5277，在97%相似水平下聚类为用于物种分类的OTU，统计得到各个样品在不同OTU中的丰度信息。标准化后的序列数大于10000条，说明测序效果很好，满足后续基因多样性及丰度等功能分析。 表1 各样品reads数及OTUs数
[处理 原始序列数 原始OTUs数 标准化后的序列数 标准化后的OTUs数 CK 54492 5277 42212 4112 RT1 48889 4510 42212 4341 RT2 57879 4803 42212 4225 RT3 50243 4563 42212 4306 RT4 52286 4392 42212 4183 PT1 48935 4514 42212 4325 PT2 56752 4581 42212 4400 PT3 54492 4515 42212 4343 PT4 52872 4456 42212 4128 ]
注：CK：移摘前土壤;T1：常规施肥;T2：腐殖酸型有机无机复混肥;T3：腐殖酸型生物有机肥;T4：-N20%腐殖酸型生物有机肥。R：团棵期;P：采收期。下同。
稀释曲线[9]是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefaction curve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样本的测序深度情况。试验所有样品在相似度0.97条件下的稀释曲线如图1所示，曲线趋向平坦，测序量均达到10000条以上，可以满足分析要求。
2 结果与分析
2.1 各土壤样品细菌群落的丰富度和多样性 Chao1指数和ACE指数反映细菌群落丰富度，其值越高表明群落物种的丰富度越高[10-11];Shannon指数反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性程度越高;Simpson指数反映了物种的优势度[10-12]。由表2可以看出，物种覆盖率为0.969～0.971，团棵期和采收期各处理的ACE指数和Chao1指数较CK均有所增加，说明施肥可以提高土壤细菌群落丰富性，其中采摘期处理2和处理3的ACE指数显著高于CK，说明施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥有助于提高土壤细菌群落丰富度。Simpson指数和Shannon指数变化范围都很小。试验结果表明施肥处理对土壤细菌群落丰富度存在一定影响，且在烟草不同生育期表现存在差异。
2.2 不同施肥处理土壤细菌类群 为了直观展示多样品间OTUs情况，用在属的水平相对丰度排名前50的细菌属进行双向二维聚类（图2），通过颜色的梯度及相似程度来反映数据的相似性和差异性，可以清楚获知样本间发生的变化。由图2可以看出，9个土壤样品分成2大类，RT3单独为一类，CK和其他处理为一类，其中同一时期的处理土壤样品细菌群落结构较相似，团棵期3个处理相似度较高，采收期处理两两聚类，相似度高。说明不同时期处理所含OTUs含量和种类差异较大。
对所有土壤样品测得的OTUs所对应的生物分类学信息进行统计表明，主要包括硝化螺旋菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单孢菌门、变形菌门，这5个门在各样品中所占比例均达4%以上，是植烟土壤中的优势菌门，图2中reads数前80的OTUs除以上5个菌门外，还分布于放线菌门。
在门的分类水平上，细菌分布在14个已知细菌门。如图3和图4所示，有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单孢菌门（Gemmatimonadetes）、绿菌门（Chlorobi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）、Latescibacteria、Parcubacteria和Saccharibacteria14个细菌门，相对丰度之和在各个处理土壤样品中均占到土壤细菌总量的95%以上。烟草CK和各处理在团棵期和采收期的优势细菌门均为变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门。在团棵期，T1处理的变形菌门相对丰度减少3.6%，绿弯菌门和酸杆菌门分别增加6%和2.8%，T4处理的绿弯菌门相对丰度增加4%，T2和T3处理变形菌门的相对丰度分别增加2.3%和2.8%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少;采收期，T1处理的变形菌门相对丰度增加2.9%，绿弯菌门和酸杆菌门分别减少0.7%和2.1%，T4处理的变形菌门相对丰度增加3%，酸杆菌门减少1.6%，T2和T3处理变形菌门的相对丰度分别增加4.2%和2.6%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少，在生育期变化趋势较一致。
通过Venn图（图5）分析了不同生育期土壤细菌共有的属的数量及特有的属，共有7210个属，均有分布的属有5290个：团棵期属的种类最多，为6935个;CK处理中属的种类最少，为5486个。CK中独有的属有21个，团棵期和成熟期分别有147个和229个。可见，使用肥料后随着生育期的推进可增加特有物种。
2.3 不同施肥处理的主成分 主坐标轴PC1可解释全部土壤样品细菌群落丰度和多样性方差的22.22%，主坐标轴PC2可解释全部土壤样品细菌群落的13.17%，两者累计可解释全部样品的35.39%（图6）[12]。样品多样性组成越相似，在PCA图中代表样品点间距离越近，CK和团棵期的各处理分散度较低，说明土壤样品性质相似，成熟期各处理较分散，說明土壤样品性质存在一定差异[13]。
2.4 不同施肥处理土壤细菌类群与土壤环境因子相关性 酸杆菌科的相对丰度与土壤pH呈正相关，经图3和图4分析常规施肥处理的酸杆菌门相对丰度增加2.8%，采收期减少2.1%，通过Heatmap图分析可知，酸杆菌科的相对丰度与施肥造成土壤pH的变化相关（图7）。丛毛单孢菌科、黄色杆菌科和芽单孢菌科同属于变形菌门，分别与TP、TN、AK正相关，说明土壤中NP含量、K的利用程度与优势菌门变形菌门的相对丰度变化相关。亚硝化单孢菌科与土壤pH呈负相关;浮霉菌科与TP负相关，黄单孢杆菌科与SOM呈正相关，与TN负相关;鞘酯菌科与TP、AP、AK均呈正相关。 3 结论与讨论
长期有机无机肥配施能够培肥地力[14]，而施用微生物菌肥可以将土壤微生态环境由紊乱复原到健康水平，从而起到防治土传病害的作用[15]。土壤微生物多样性相对比较稳定，长期合理施肥可以对土壤微生物群落结构和多样性产生一定的影響[16]，但短期施肥对土壤微生物的影响不显著[17]。本研究结果表明，不同施肥处理和不同生育期土壤细菌群落在结构上的差异不明显，而细菌群落的相对丰度存在差异，说明施肥造成了某些细菌类群的富集或衰减，而没有改变细菌群落种类，施肥等条件只影响了某些细菌种群的丰度。
植物根际细菌作为一类重要的微生物，与植物的生长发育有着密切的关系[19-21]。烟草种植土壤中细菌类群丰富，优势细菌门有变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门，其中变形菌门的相对丰度最大，为29.2%～35.8%。施用不同肥料改变了烟草种植土壤的理化性质，因此对土壤中细菌优势类群的相当丰度产生一定的影响。齐虹凌等[21]对不同菌群的相对丰度变化研究发现，细菌群落在烤烟生长的早期数量变化较大，而随着生育期的推进细菌群落相对丰度变化不明显。本研究中常规施肥的土壤在团棵期，变形菌门的相对丰度减少3.6%，采收期增加了2.9%;团棵期绿弯菌门和酸杆菌门分别增加6%和2.8%，采收期分别减少0.7%和2.1%，酸杆菌为嗜酸菌在土壤中分布广泛，酸杆菌门的相对丰度在不同生育期的变化与施肥后土壤pH变化有关;施用减氮20%腐殖酸型生物有机肥的土壤，在团棵期绿弯菌门的相对丰度增加4%，采收期变形菌门相对丰度增加3%，酸杆菌门减少1.6%，这与王培雯等[22]土壤脲酶与土壤细菌群落丰度和多样性均呈现反相关，单一的氮素水平增加不利于土壤细菌群落结构变化的研究结果基本一致。施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥的土壤变形菌门的相对丰度分别增加2.3%和2.8%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少;采收期，施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥的土壤变形菌门的相对丰度分别增加4.2%和2.6%，绿弯菌门和酸杆菌门略有减少，在生育期变化趋势较一致。本研究中施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥在烟草不同生育期对土壤优势菌门的相对丰度影响趋于稳定，说明这2种肥料对土壤细菌群落的影响是一个长期的相对稳定的变化过程，肥料中营养元素的配比对土壤细菌群落也有一定的影响。
Liu等[23-24]的研究表明土壤理化性质，尤其是土壤pH和土壤有机质对土壤细菌群落组成和多样性有显著影响。本研究中酸杆菌科的相对丰度与土壤pH呈正相关，这与不同生育期酸杆菌科的相对丰度和土壤pH的变化相吻合，由此可知酸杆菌科的相对丰度与施肥造成土壤pH的变化相关，印证了Liu等[23]的研究结果。变形菌门为细菌中最大的1个门，其中不乏土壤有益菌群，丛毛单孢菌科、黄色杆菌科和芽单孢菌科同属于变形菌门，其相对丰度分别与土壤全氮、全磷、速效钾呈正相关，说明优势菌门变形菌门的相对丰度变化与土壤中全磷、速效钾含量相关。亚硝化单孢菌科、芽单孢菌科的相对丰度与土壤pH呈负相关;浮霉菌科的相对丰度与全磷呈负相关，黄单孢杆菌科的相对丰度与土壤有机质呈正相关，与全氮呈负相关;鞘酯菌科的相对丰度与土壤全磷、速效磷、速效钾均呈正相关。
施用不同肥料对烟草土壤细菌优势类群的相对丰度及群落结构的影响不尽相同，施用常规施肥和-N20%腐殖酸型生物有机肥对烟草土壤细菌优势类群的相对丰度及群落结构的影响大于施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥，施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥在烟草不同生育期对土壤优势菌门的相对丰度影响趋于一致，但施用腐殖酸型有机无机复混肥和腐殖酸型生物有机肥可以提高土壤细菌的多样性。
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（责编：徐世红）