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摘 要：随着人们对微生物研究的深入，传统的农田土壤微生物分离培养与鉴定方式逐渐暴露出问题，很难满足深入了解微生物的生态学特性与多样性的需求。研究农田土壤多样性的过程中应用分子生物学，不仅能获取农田土壤微生物群落的更多相关信息，还可以解决传统研究方式无法培养农田土壤微生物的问题。阐述了农田土壤微生物多样性的定义，介绍了研究农田土壤微生物多样性的重要意义，对分子生物学在农田土壤微生物多样性研究中的应用进行了具体分析，希望为分子生物学在农田土壤微生物多样性研究中的应用提供借鉴。
关键词：分子生物学;农田土壤微生物;多样性;重要性;应用
文章编号： 1005-2690（2021）14-0091-02 中国图书分类号： S154.3 文献标志码： B
微生物在整个地球物质循环中充当着生产者与分解者的角色，是延续生命的关键。人类对于农田土壤微生物多样性的研究绝大多数还处于未知状态，研究农田土壤微生物多样性可以帮助人类有效开发微生物资源、改善环境污染问题、维持生态服务功能以及促进农田土壤可持续性利用。
人类最初采用平板计数法来研究农田土壤微生物多样性，但是这种方式存在一定的问题，比如在研究时会忽略不可培养微生物，使生長速度快、产孢量大的微生物数量增加等[1]，后来逐渐研究出其他方式帮助人类认识农田土壤微生物多样性。目前应用比较普遍的是以分子生物学为基础的分子技术，比如核糖体间隔序列分析、核酸分子杂交技术等。在高通量测序技术不断发展的同时，其在农田土壤微生物多样性领域的运用也越来越深入。
1 农田土壤微生物多样性的定义
农田土壤微生物群落之间在种群与种间上具有差异性，在维持农田土壤的质量与生态系统的平衡等方面发挥着重要作用。
农田土壤生态系统的稳定、和谐以及其对微生态环境恶化的缓冲能力与农田土壤微生物群落的多样性、结构均匀性紧密相关。农田土壤微生物的多样性表现为生物在物种、遗传、结构及功能方面的差异与变化，体现了微生物群落会受到农田土壤生态机制因素的影响[2]。同时，也可以将农田土壤微生物多样性理解为微生物生命丰富，用农田土壤生物区的变化与生物化学过程之间的关系来解释。
2 农田土壤微生物多样性的重要性
随着人类社会的发展，土地资源的需求越来越大、破坏也越来越严重，地球生态系统所提供的资源与其恢复能力有限。陆地上所有生态系统的结构与功能的基础就是农田土壤，其最重要的构成部分之一是农田土壤微生物，能够帮助农田土壤进行有机质分解、腐烂、繁殖等生化活动，是促进农田土壤有机质转化与养分循环的关键因素。
除此之外，农田土壤微生物是显示农田土壤肥力活性水平的重要指标，是储备养分的“仓库”，是植物生长所需养分的主要来源，在农田土壤生态系统中发挥着不可或缺的作用[3]。
植物多样性与农田土壤微生物多样性之间有紧密的联系，植物通过影响农田土壤环境，影响农田土壤微生物的多样性与构成，农田土壤微生物的多样性及构成代表着对生态环境的适应能力。重金属、杀虫剂这种对植物或动物有害的物质，一旦使用剂量超过规定限度，就会对农田土壤微生物多样性安全产生威胁。在此基础上，有专家学者提议利用农田土壤微生物与各种污染物之间的反应，来帮助确定农田土壤污染与制定农田土壤环境容量标准。所以，加强对农田土壤微生物多样性的研究非常重要。
3 分子生物学在农田土壤微生物多样性研究中的应用
3.1 农田土壤微生物 DNA 复性动力学分析
研究显示，微生物多样性越复杂，其DNA的同源性就越差，复性率就越低。所以，可以通过测定群落的DNA同源性与复性率得到农田土壤微生物的群落构成和遗传多样性。
Torsvik V等研究者利用DNA复性动力学分析法对不同程度重金属污染的农田土壤中微生物多样性的变化进行研究，结果表明，没有被污染的对照农田土壤中有16 000个细菌基因组，低度重金属污染的农田土壤中含有6 400个细菌基因组，高度重金属污染的农田土壤中含有2 000个细菌基因组，通过分析可知，农田土壤被重金属污染的程度越高，微生物多样性越少[4]。但是需要注意这种方式的分辨率较低，单纯使用此方法，只能得到农田土壤微生物群落的大致差异，并不能表明其多样性的变化，想要得到确切的结果，需要与核酸分子杂交技术等相结合。
3.2 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是在20世纪70年代新出现的一种分子生物学技术。以核酸分子碱基互补配对原理为基础，通过将待测样品的DNA或RNA与特异性探针杂交形成新分子[5]。
因为核酸分子杂交技术具有较高的灵敏性与特异性，从出现后就被广泛运用于研究农田土壤微生物的多样性。RNA基因探针、编码代谢酶基因探针等都是经常应用于研究的探针，尤其是近几年发展起来的荧光原位杂交技术，是进行不可培养微生物群落多样性研究的常用方式。
3.3 基于PCR的分子生物学研究技术
3.3.1 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（DGGE/
TGGE）
通过使用化学变性剂或温度处理DNS双链分子，从而将其分离成序列不同但长度相等的DNA片段，依据电泳条带的数量和位置大概确定农田土壤中微生物的类别，粗略分析农田土壤微生物多样性。
DGGE/TGGE技术可以同时测定不同农田土壤中微生物群落的组成与变化情况，具有较高的灵敏性、可重复性、迅速性，应用范围较广。但是DGGE/TGGE技术并不能检测到所有的微生物多样性，尤其是很难检测到劣势的微生物种群。 3.3.2 单链构象多态性（SSCP）
碱基的变化会引起单链DNA构象的变化，不同空间构象的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型也不一样，以此辨别大小相同但二级结构不同的PCR产物[6]。
SSCP技术在研究根系微生物、受污染的农田土壤微生物等的多样性方面已经被广泛应用。该技术比传统的方式更加节约时间、节省成本，降低了误差，适用于分析微生物群落的组成结构。
3.3.3 扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）
在PCR选择性扩增核糖体DNA片段的基础上，分析核糖体DNA限制性酶切片段长度的多态性。此技术不被菌株是否为纯培养所限制，不会受到宿主的干扰，因此，其效率较高、特异性较强，多被运用于发现新物种、鉴定微生物、检测遗传性等。
3.3.4 随机引物扩增多态性方法（RAPD）
RAPD利用随机引物，且引物对农田土壤微生物群落的DNA没有特异选择性[7]。所以，农田土壤微生物群落DNA序列组成的差异性，可以通过扩增的条带数间接反映出来。扩增的条带数越少，则DNA序列越简单，充分显示了农田土壤微生物群落序列多样性的某一侧面，但是并不能展示出群落DNA序列相对多度的信息。
3.3.5 扩增片段长度多态性（AFLP）
AFLP是基于PCR和RFLP的一种DNA指纹技术[8]。此技术集合PCR的高效性与RFLP的可靠性，利用切割两种以上的酶形成不同酶切位点的限制酶切片段，在其上添加双链人工接头，并结合引物与酶切片段识别序列，实现选择性扩增。此方法可以更好地展示微生物的多样性，由于AFLP标记数目从理论上来说是没有限制的，所以具有较好的重复性[9-11]。
4 结语
分子生物学技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用，为进行农田土壤领域的研究工作提供了重要的技术支持与更广阔的探索空间，因此，将分子生物学与其他方式相结合，将推动农田土壤微生物多样性研究工作的发展。
参考文献：
[ 1 ] 吴丽莉.浅谈分子生物学在农田土壤微生物多样性研究中的应用[J].黑龙江教育（理论与实践），2017（Z2）：81-82.
[ 2 ] 曹万举，隋心，韩士杰，等.分子生物学技术在农田土壤微生物多样性中的应用[J].Bioprocess，2018，3（3）：23-28.
[ 3 ] 陈慧清，李晓晨，于学峰，等.农田土壤生态系统微生物多樣性技术研究进展[J].地球与环境，2018，46（2）：204-209.
[ 4 ] Ruth-Anne Sandaa，Torsvik V，Enger I，et al.Analysis of bacterial communities in heavy metal-contaminated soils at dif-ferent levels of resolution[J].FEMS Microbiology Ecology，2019，30（3）：237-251.
[ 5 ] 王新珍，王凤花，孙瑞波，等.高通量测序技术在微生物分子生态学研究中的应用[J].中国生态农业学报，2018，26（10）：174-181.
[ 6 ] 李婷婷，张西美.全球变化背景下内蒙古草原农田土壤微生物多样性维持机制研究进展[J].生物多样，2020，28（6）： 749，758.
[ 7 ] 张海龙，石竹.分子生物学技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用[J].中国生物学文摘，2017，21（9）：21.
[ 8 ] 李原园，张映.AFLP技术及其应用[J].国外畜牧学（猪与禽），2009，29（6）：94-96.
[ 9 ] 张宝成，邵代兴，苏丽萍，等.湄潭县抄乐乡农田土壤氮分布研究[J].青海大学学报，2018，36（4）：59-63.
[ 10 ] 王雅芝，齐鹏，王晓娇，等.Meta分析中国保护性耕作对土壤微生物多样性的影响[J].草业科学，2021，38（2）：378-392.
[ 11 ] 李慧，陈冠雄，张颖.分子生物学方法在污染土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报，2004（4）：612-617.
关键词：分子生物学;农田土壤微生物;多样性;重要性;应用
文章编号： 1005-2690（2021）14-0091-02 中国图书分类号： S154.3 文献标志码： B
微生物在整个地球物质循环中充当着生产者与分解者的角色，是延续生命的关键。人类对于农田土壤微生物多样性的研究绝大多数还处于未知状态，研究农田土壤微生物多样性可以帮助人类有效开发微生物资源、改善环境污染问题、维持生态服务功能以及促进农田土壤可持续性利用。
人类最初采用平板计数法来研究农田土壤微生物多样性，但是这种方式存在一定的问题，比如在研究时会忽略不可培养微生物，使生長速度快、产孢量大的微生物数量增加等[1]，后来逐渐研究出其他方式帮助人类认识农田土壤微生物多样性。目前应用比较普遍的是以分子生物学为基础的分子技术，比如核糖体间隔序列分析、核酸分子杂交技术等。在高通量测序技术不断发展的同时，其在农田土壤微生物多样性领域的运用也越来越深入。
1 农田土壤微生物多样性的定义
农田土壤微生物群落之间在种群与种间上具有差异性，在维持农田土壤的质量与生态系统的平衡等方面发挥着重要作用。
农田土壤生态系统的稳定、和谐以及其对微生态环境恶化的缓冲能力与农田土壤微生物群落的多样性、结构均匀性紧密相关。农田土壤微生物的多样性表现为生物在物种、遗传、结构及功能方面的差异与变化，体现了微生物群落会受到农田土壤生态机制因素的影响[2]。同时，也可以将农田土壤微生物多样性理解为微生物生命丰富，用农田土壤生物区的变化与生物化学过程之间的关系来解释。
2 农田土壤微生物多样性的重要性
随着人类社会的发展，土地资源的需求越来越大、破坏也越来越严重，地球生态系统所提供的资源与其恢复能力有限。陆地上所有生态系统的结构与功能的基础就是农田土壤，其最重要的构成部分之一是农田土壤微生物，能够帮助农田土壤进行有机质分解、腐烂、繁殖等生化活动，是促进农田土壤有机质转化与养分循环的关键因素。
除此之外，农田土壤微生物是显示农田土壤肥力活性水平的重要指标，是储备养分的“仓库”，是植物生长所需养分的主要来源，在农田土壤生态系统中发挥着不可或缺的作用[3]。
植物多样性与农田土壤微生物多样性之间有紧密的联系，植物通过影响农田土壤环境，影响农田土壤微生物的多样性与构成，农田土壤微生物的多样性及构成代表着对生态环境的适应能力。重金属、杀虫剂这种对植物或动物有害的物质，一旦使用剂量超过规定限度，就会对农田土壤微生物多样性安全产生威胁。在此基础上，有专家学者提议利用农田土壤微生物与各种污染物之间的反应，来帮助确定农田土壤污染与制定农田土壤环境容量标准。所以，加强对农田土壤微生物多样性的研究非常重要。
3 分子生物学在农田土壤微生物多样性研究中的应用
3.1 农田土壤微生物 DNA 复性动力学分析
研究显示，微生物多样性越复杂，其DNA的同源性就越差，复性率就越低。所以，可以通过测定群落的DNA同源性与复性率得到农田土壤微生物的群落构成和遗传多样性。
Torsvik V等研究者利用DNA复性动力学分析法对不同程度重金属污染的农田土壤中微生物多样性的变化进行研究，结果表明，没有被污染的对照农田土壤中有16 000个细菌基因组，低度重金属污染的农田土壤中含有6 400个细菌基因组，高度重金属污染的农田土壤中含有2 000个细菌基因组，通过分析可知，农田土壤被重金属污染的程度越高，微生物多样性越少[4]。但是需要注意这种方式的分辨率较低，单纯使用此方法，只能得到农田土壤微生物群落的大致差异，并不能表明其多样性的变化，想要得到确切的结果，需要与核酸分子杂交技术等相结合。
3.2 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是在20世纪70年代新出现的一种分子生物学技术。以核酸分子碱基互补配对原理为基础，通过将待测样品的DNA或RNA与特异性探针杂交形成新分子[5]。
因为核酸分子杂交技术具有较高的灵敏性与特异性，从出现后就被广泛运用于研究农田土壤微生物的多样性。RNA基因探针、编码代谢酶基因探针等都是经常应用于研究的探针，尤其是近几年发展起来的荧光原位杂交技术，是进行不可培养微生物群落多样性研究的常用方式。
3.3 基于PCR的分子生物学研究技术
3.3.1 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（DGGE/
TGGE）
通过使用化学变性剂或温度处理DNS双链分子，从而将其分离成序列不同但长度相等的DNA片段，依据电泳条带的数量和位置大概确定农田土壤中微生物的类别，粗略分析农田土壤微生物多样性。
DGGE/TGGE技术可以同时测定不同农田土壤中微生物群落的组成与变化情况，具有较高的灵敏性、可重复性、迅速性，应用范围较广。但是DGGE/TGGE技术并不能检测到所有的微生物多样性，尤其是很难检测到劣势的微生物种群。 3.3.2 单链构象多态性（SSCP）
碱基的变化会引起单链DNA构象的变化，不同空间构象的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型也不一样，以此辨别大小相同但二级结构不同的PCR产物[6]。
SSCP技术在研究根系微生物、受污染的农田土壤微生物等的多样性方面已经被广泛应用。该技术比传统的方式更加节约时间、节省成本，降低了误差，适用于分析微生物群落的组成结构。
3.3.3 扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）
在PCR选择性扩增核糖体DNA片段的基础上，分析核糖体DNA限制性酶切片段长度的多态性。此技术不被菌株是否为纯培养所限制，不会受到宿主的干扰，因此，其效率较高、特异性较强，多被运用于发现新物种、鉴定微生物、检测遗传性等。
3.3.4 随机引物扩增多态性方法（RAPD）
RAPD利用随机引物，且引物对农田土壤微生物群落的DNA没有特异选择性[7]。所以，农田土壤微生物群落DNA序列组成的差异性，可以通过扩增的条带数间接反映出来。扩增的条带数越少，则DNA序列越简单，充分显示了农田土壤微生物群落序列多样性的某一侧面，但是并不能展示出群落DNA序列相对多度的信息。
3.3.5 扩增片段长度多态性（AFLP）
AFLP是基于PCR和RFLP的一种DNA指纹技术[8]。此技术集合PCR的高效性与RFLP的可靠性，利用切割两种以上的酶形成不同酶切位点的限制酶切片段，在其上添加双链人工接头，并结合引物与酶切片段识别序列，实现选择性扩增。此方法可以更好地展示微生物的多样性，由于AFLP标记数目从理论上来说是没有限制的，所以具有较好的重复性[9-11]。
4 结语
分子生物学技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用，为进行农田土壤领域的研究工作提供了重要的技术支持与更广阔的探索空间，因此，将分子生物学与其他方式相结合，将推动农田土壤微生物多样性研究工作的发展。
参考文献：
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[ 11 ] 李慧，陈冠雄，张颖.分子生物学方法在污染土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报，2004（4）：612-617.