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摘要[目的] 研究睡眠剥夺对雄性小鼠性行为及精子活性的影响。[方法] 用轻柔刺激法睡眠剥夺昆明雄性小鼠36 h，观察其性行为，通过镜检计算精子活率和精子畸变率。 [结果] 36 h 睡眠剥夺后，捕捉潜伏期极显著升高（P<001），捕捉次数极显著降低（P<001）。36 h睡眠剥夺后精子活率显著降低（P<0.05），精子畸变率极显著升高（P<0.01）。[结论] 36 h睡眠剥夺可对雄性小鼠性行为及精子质量产生明显不良影响。
关键词睡眠剥夺；捕捉次数；捕捉潜伏期；精子活率；精子畸变率
中图分类号S865.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）24-106-02
随着经济的发展，近年来越来越多的人受到不断增加的工作和生活压力，不同职业的人都可能处于不同程度的睡眠剥夺（Sleep deprivation，SD）状态。研究表明，睡眠剥夺影响机体的代谢、免疫系统、应激及神经系统、内分泌系统等方面，与人体的各种疾病如心血管疾病，肥胖症，精神焦虑，抑郁症等的发生密切相关[1-3]。被动的睡眠剥夺已经成为日益突出的医疗及公共卫生问题。
目前，有关睡眠剥夺导致的雄性小鼠性行为及精子质量的研究较为少见。研究表明，72 h的睡眠剥夺会造成雄性小鼠性行为异常和生殖系统的不良影响[4-5]，还有研究表明对小鼠进行一定时间的睡眠剥夺后可引起雄性小鼠的生殖毒性效应[6]。但是，中等时长（如36 h）的睡眠剥夺对雄性小鼠性行为及精子活力的影响仍缺乏深入明确的认识。笔者采用轻微改良的轻柔刺激法研究36 h睡眠剥夺对雄性小鼠性行为及精子质量的影响，以睡眠剥夺后捕捉次数、捕捉潜伏期、精子活率和精子畸变率为主要评价指标，旨在为睡眠剥夺影响雄性动物生殖行为及精子质量提供理论参考。
1材料与方法
1.1实验动物
取雄性昆明小鼠24只，体重（26±4）g，实验室内饲养，12 h光照、12 h黑暗处理，室温为（25±5）℃，所有小鼠均正常取食与给水。将小鼠适应性饲养7 d后，随机分成2组，每组12只，进行试验。
1.2试验分组
采用改良的轻柔刺激法[7]，实验人员轮流值班，拍打小鼠笼发出声音，从而使小鼠不能进入睡眠状态。如果小鼠长时间不睡眠而陷入不活跃状态，则用棍状物直接刺激小鼠使其无法进入睡眠。对照组，不作睡眠剥夺（SD）处理；试验组，第1天8：00到次日20：00SD处理36 h；正常饲喂与饮水。
1.3方法
1.3.1小鼠性行为。36 h SD处理后，保持实验室安静，将处理组和对照组的成熟雄性小鼠放入290 mm×178 mm ×160 mm的鼠笼中适应5 min，接着与2只同批饲养的成熟雌性小鼠形成1∶2配对，观察30 min。观察指标包括：①捕捉潜伏期（Capture incubation period，CIP）：计算雌鼠投入到鼠笼直到雄鼠第1次捕捉雌鼠的时间。②捕捉次数（Capture times，CT）：自雌鼠投入到鼠笼开始，雄鼠扑捉雌鼠的动作，主要是爬背或添阴动作次数。
1.3.2精子活率。解剖小鼠后，将任意一侧附睾用剪刀剪碎，然后放入1 ml的0.86%生理盐水中，生理盐水需要预热至37 ℃，再水浴10 min，制成精子悬液。取1滴悬液，滴于载玻片，在显微镜（100×）暗视野下观察，共观察200个精子，使用计数器手动记录下精子运动情况。将精子活力依据文献分级：A.快速直线向前；B.慢速直线向前或转动向前；C.原地颤动或转动；D.不活动。精子活率=A+B+C /A+B+C+D[8]。
1.3.3精子畸变率。取“1.3.2”的精子悬浮液进行涂片，玻片干燥后用甲醇固定5 min。干后用2%伊红（Eosin）水溶液染色1 h[9]。检查精子形态，每只小鼠检查完整的精子1 000条。
1.3.4数据统计与分析。使用SPSS19.0统计软件对试验数据进行数据处理，首先对试验数据进行正态性检验和方差齐性检验。符合正态分布和方差齐性则采用独立样本t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。试验结果以± SE表示。
2结果与分析
2.1性行为观察
从图1可以看出，小鼠捕捉潜伏期在36 h SD处理后较对照组延长，与对照组存在极显著差异（P<001），处理组捕捉潜伏期极显著高于对照组（P<0.01）。
从图2可以看出，36 h SD处理后，处理组捕捉次数极显著低于对照组（P<0.01）。
2.2精子活率
从图3可以看出，SD 处理36 h后小鼠的精子活率比对照组（0 h）低，且存在显著性差异（P<0.05）；对照组A级精子数明显高于处理组，且36 h处理组有4只小鼠没有观察到A级精子。
2.3精子畸变率
从图4可以看出，小鼠精子畸变率在 SD 36 h 处理后较对照组有明显升高，且处理组与对照组存在极显著差异（P<0.01）。36 h SD组多见明显畸变精子，以尾折叠、不定形头部为常见。
3结论与讨论
雄性动物的捕捉潜伏期（Capture incubation period，CIP）和捕捉次数（Capture times，CT）的改变作为一种生殖行为异常的特征，已被许多学者推荐或用于评价雄性生殖行为异常[4，10]。CIP和CT的改变是评价性功能的最优指标。该研究表明，睡眠剥夺对雄性小鼠CIP和CT有显著影响，与对照组相比睡眠剥夺36 h可使雄性小鼠潜伏期极显著延长（P<0.01），捕捉次数极显著减少（P<0.01）。这表明中长时间的睡眠剥夺（36 h SD）可使小鼠性行为能力明显降低。
研究表明，长时间的睡眠剥夺可使小鼠精子活率显著下降[5]。该研究表明中长时间（36 h）睡眠剥夺也可使精子活率有明显的下降趋势（P<0.05）。睡眠剥夺能使精子活率下降，可能与氧自由基生成过多产生氧化应激有关[11]。该研究还发现，睡眠剥夺36 h可使小鼠精子畸变率极显著升高（P<0.01），其精子畸变多表现为无钩、胖头、无定形、尾折叠。尤其尾折叠和无定形现象已经比较明显，说明36 h的睡眠剥夺已经对雄性动物精子质量及子代健康造成严重威胁。 参考文献
[1] RECHTSCHAFFEN A，BERGMANN B M.Sleep deprivation and host defense [J].American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2001（2）：602-603.
[2] HEALY D，WATERHOUSE J M.？Reactive rhythms and endogenous clocks [J].Psychological Medicine，1991（3）：557-564.
[3] HASLER G，BUYSSE D，KLAGHOFER R.The association between short sleep duration and obesity in young adults：A 13-year prospective study[J].Sleep，2004，27（4）：661-666.
[4] 周东升，周锦，郑池乐，等.睡眠剥夺对雄性小鼠体重及性行为的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2014，467（12）：189-191.
[5] 周东升，周锦，郑池乐，等.睡眠剥夺对雄性小鼠生殖系统的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2015，469（1）：15-19.
[6] 蒋超，周冉，夏聪聪，等.72h睡眠剥夺对雄性小鼠的生殖毒性效应及机制[J].现代预防医学，2013（7）：1325-1326.
[7] ZHANG J Y，CHEN Z T，TAISHI P，et al.Sleep deprivation increases rat hypothalamic growth hormone-releasing hormone mRNA [J].American Journal of Physiology-Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，1998，275（6）：1755-1761.
[8] 陈亚.丙烯晴对雄性小鼠生殖毒性研究[D].兰州：兰州大学，2010.
[9] 秦椿华，丁健中.化学物致突变致癌检测技术[M].乌鲁木齐：新疆卫生科技出版社，1996：89.
[10] 王心如.毒理学基础[M].4版.北京：人民卫生出版社，2003：238-239.
[11] 吴晶晶，樊慧杰，王贵吉.Smad7和TGF-β_1在结直肠癌中的表达及意义[J].中国现代药物应用，2010，4（13）：23-24.
关键词睡眠剥夺；捕捉次数；捕捉潜伏期；精子活率；精子畸变率
中图分类号S865.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）24-106-02
随着经济的发展，近年来越来越多的人受到不断增加的工作和生活压力，不同职业的人都可能处于不同程度的睡眠剥夺（Sleep deprivation，SD）状态。研究表明，睡眠剥夺影响机体的代谢、免疫系统、应激及神经系统、内分泌系统等方面，与人体的各种疾病如心血管疾病，肥胖症，精神焦虑，抑郁症等的发生密切相关[1-3]。被动的睡眠剥夺已经成为日益突出的医疗及公共卫生问题。
目前，有关睡眠剥夺导致的雄性小鼠性行为及精子质量的研究较为少见。研究表明，72 h的睡眠剥夺会造成雄性小鼠性行为异常和生殖系统的不良影响[4-5]，还有研究表明对小鼠进行一定时间的睡眠剥夺后可引起雄性小鼠的生殖毒性效应[6]。但是，中等时长（如36 h）的睡眠剥夺对雄性小鼠性行为及精子活力的影响仍缺乏深入明确的认识。笔者采用轻微改良的轻柔刺激法研究36 h睡眠剥夺对雄性小鼠性行为及精子质量的影响，以睡眠剥夺后捕捉次数、捕捉潜伏期、精子活率和精子畸变率为主要评价指标，旨在为睡眠剥夺影响雄性动物生殖行为及精子质量提供理论参考。
1材料与方法
1.1实验动物
取雄性昆明小鼠24只，体重（26±4）g，实验室内饲养，12 h光照、12 h黑暗处理，室温为（25±5）℃，所有小鼠均正常取食与给水。将小鼠适应性饲养7 d后，随机分成2组，每组12只，进行试验。
1.2试验分组
采用改良的轻柔刺激法[7]，实验人员轮流值班，拍打小鼠笼发出声音，从而使小鼠不能进入睡眠状态。如果小鼠长时间不睡眠而陷入不活跃状态，则用棍状物直接刺激小鼠使其无法进入睡眠。对照组，不作睡眠剥夺（SD）处理；试验组，第1天8：00到次日20：00SD处理36 h；正常饲喂与饮水。
1.3方法
1.3.1小鼠性行为。36 h SD处理后，保持实验室安静，将处理组和对照组的成熟雄性小鼠放入290 mm×178 mm ×160 mm的鼠笼中适应5 min，接着与2只同批饲养的成熟雌性小鼠形成1∶2配对，观察30 min。观察指标包括：①捕捉潜伏期（Capture incubation period，CIP）：计算雌鼠投入到鼠笼直到雄鼠第1次捕捉雌鼠的时间。②捕捉次数（Capture times，CT）：自雌鼠投入到鼠笼开始，雄鼠扑捉雌鼠的动作，主要是爬背或添阴动作次数。
1.3.2精子活率。解剖小鼠后，将任意一侧附睾用剪刀剪碎，然后放入1 ml的0.86%生理盐水中，生理盐水需要预热至37 ℃，再水浴10 min，制成精子悬液。取1滴悬液，滴于载玻片，在显微镜（100×）暗视野下观察，共观察200个精子，使用计数器手动记录下精子运动情况。将精子活力依据文献分级：A.快速直线向前；B.慢速直线向前或转动向前；C.原地颤动或转动；D.不活动。精子活率=A+B+C /A+B+C+D[8]。
1.3.3精子畸变率。取“1.3.2”的精子悬浮液进行涂片，玻片干燥后用甲醇固定5 min。干后用2%伊红（Eosin）水溶液染色1 h[9]。检查精子形态，每只小鼠检查完整的精子1 000条。
1.3.4数据统计与分析。使用SPSS19.0统计软件对试验数据进行数据处理，首先对试验数据进行正态性检验和方差齐性检验。符合正态分布和方差齐性则采用独立样本t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。试验结果以± SE表示。
2结果与分析
2.1性行为观察
从图1可以看出，小鼠捕捉潜伏期在36 h SD处理后较对照组延长，与对照组存在极显著差异（P<001），处理组捕捉潜伏期极显著高于对照组（P<0.01）。
从图2可以看出，36 h SD处理后，处理组捕捉次数极显著低于对照组（P<0.01）。
2.2精子活率
从图3可以看出，SD 处理36 h后小鼠的精子活率比对照组（0 h）低，且存在显著性差异（P<0.05）；对照组A级精子数明显高于处理组，且36 h处理组有4只小鼠没有观察到A级精子。
2.3精子畸变率
从图4可以看出，小鼠精子畸变率在 SD 36 h 处理后较对照组有明显升高，且处理组与对照组存在极显著差异（P<0.01）。36 h SD组多见明显畸变精子，以尾折叠、不定形头部为常见。
3结论与讨论
雄性动物的捕捉潜伏期（Capture incubation period，CIP）和捕捉次数（Capture times，CT）的改变作为一种生殖行为异常的特征，已被许多学者推荐或用于评价雄性生殖行为异常[4，10]。CIP和CT的改变是评价性功能的最优指标。该研究表明，睡眠剥夺对雄性小鼠CIP和CT有显著影响，与对照组相比睡眠剥夺36 h可使雄性小鼠潜伏期极显著延长（P<0.01），捕捉次数极显著减少（P<0.01）。这表明中长时间的睡眠剥夺（36 h SD）可使小鼠性行为能力明显降低。
研究表明，长时间的睡眠剥夺可使小鼠精子活率显著下降[5]。该研究表明中长时间（36 h）睡眠剥夺也可使精子活率有明显的下降趋势（P<0.05）。睡眠剥夺能使精子活率下降，可能与氧自由基生成过多产生氧化应激有关[11]。该研究还发现，睡眠剥夺36 h可使小鼠精子畸变率极显著升高（P<0.01），其精子畸变多表现为无钩、胖头、无定形、尾折叠。尤其尾折叠和无定形现象已经比较明显，说明36 h的睡眠剥夺已经对雄性动物精子质量及子代健康造成严重威胁。 参考文献
[1] RECHTSCHAFFEN A，BERGMANN B M.Sleep deprivation and host defense [J].American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology，2001（2）：602-603.
[2] HEALY D，WATERHOUSE J M.？Reactive rhythms and endogenous clocks [J].Psychological Medicine，1991（3）：557-564.
[3] HASLER G，BUYSSE D，KLAGHOFER R.The association between short sleep duration and obesity in young adults：A 13-year prospective study[J].Sleep，2004，27（4）：661-666.
[4] 周东升，周锦，郑池乐，等.睡眠剥夺对雄性小鼠体重及性行为的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2014，467（12）：189-191.
[5] 周东升，周锦，郑池乐，等.睡眠剥夺对雄性小鼠生殖系统的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2015，469（1）：15-19.
[6] 蒋超，周冉，夏聪聪，等.72h睡眠剥夺对雄性小鼠的生殖毒性效应及机制[J].现代预防医学，2013（7）：1325-1326.
[7] ZHANG J Y，CHEN Z T，TAISHI P，et al.Sleep deprivation increases rat hypothalamic growth hormone-releasing hormone mRNA [J].American Journal of Physiology-Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，1998，275（6）：1755-1761.
[8] 陈亚.丙烯晴对雄性小鼠生殖毒性研究[D].兰州：兰州大学，2010.
[9] 秦椿华，丁健中.化学物致突变致癌检测技术[M].乌鲁木齐：新疆卫生科技出版社，1996：89.
[10] 王心如.毒理学基础[M].4版.北京：人民卫生出版社，2003：238-239.
[11] 吴晶晶，樊慧杰，王贵吉.Smad7和TGF-β_1在结直肠癌中的表达及意义[J].中国现代药物应用，2010，4（13）：23-24.