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摘要为了明确葡萄灰霉菌对啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、腐霉利、嘧霉胺的抗药性
和对抑霉唑的敏感性，本试验采用菌丝生长速率法和孢子萌发法检测了采自山东蓬莱地区的69株葡萄灰霉菌对上述前6种杀菌剂的抗药性、对抑霉唑的敏感性及抑霉唑与其他6种杀菌剂的交互抗性关系。结果表明，抑霉唑对这69株葡萄灰霉菌的EC50分布在0.403～28.76 μg/mL之间，平均值为（9.34±10.34）μg/mL;葡萄灰霉菌菌株中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌灵（CarR）、咯菌腈（FluR）、异菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分别为100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%，测试菌株的抗药性均为多抗类型，没有单抗菌株，其中对3种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺）、对4种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺）、对5种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利或啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺）和对6种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的抗性频率分别为2.33%、9.30%、79.07%、2.33%、6.97%，表明啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺对测试葡萄菌株完全丧失防效，建议在该葡萄产区停止使用这些药剂，测试菌株对腐霉利、异菌脲的抗性频率高，建议采取限制使用、禁止单独使用等措施，测试菌株对咯菌腈的抗性频率较低，可以继续使用但需按照科学使用规则进行。抑霉唑与其他6种杀菌剂间不存在交互抗性关系，说明其可以和其他药剂同时使用但建议减少使用。
关键词葡萄灰霉菌;杀菌剂;抑霉唑;敏感性;抗药性
中图分类号：S 436.631
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018140
灰霉病已经发展成为一种重要的世界性植物真菌类病害，由于其对经济造成严重影响，被列为世界第二大重大植物病原真菌病害[1]。灰霉病发生普遍，在经济作物的田间生长期及采后的贮藏、运输过程中均有发生。其病原真菌灰葡萄孢可引起多种双子叶农作物及包括葡萄在内的多种果蔬的灰霉病。葡萄灰霉病在我国各葡萄主产区均有发生，是葡萄成熟期和贮藏期的重要病害之一，在适宜的低温高湿的环境下极易暴发，影响葡萄品质，造成葡萄严重减产。目前，我国葡萄灰霉病的防控主要以化学防治为主，葡萄生产和贮存上主要使用的药剂包括苯并咪唑类的多菌灵、二甲酰亚胺类的腐霉利和异菌脲、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺、吡咯类的咯菌腈、烟酰胺类的啶酰菌胺、咪唑类的抑霉唑、有机硫类的福美双等。随着这些杀菌剂的高频次和大剂量使用，灰葡萄孢也普遍产生了抗药性甚至多药抗性，造成葡萄生产和贮存上严重的经济损失[2]。据报道，2014年日本大阪地区温室番茄灰霉菌对多菌灵、异菌脲的抗性频率分别达到了74.2%和86.4%[3];2015年中国浙江地区草莓灰霉菌对腐霉利、嘧霉胺的抗性频率分别达到了69.2%和93.7%[4]， 2017年德国东南部树莓灰霉菌对咯菌腈、啶酰菌胺的抗性频率均高达100%[5]。明确病原菌的抗药性及抗药性水平，是选择有效药剂的基础。
14α脱甲基酶抑制剂（14αdemethylation inhibitors， DMIs）类杀菌剂是目前农业上广泛使用的甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂，包含三唑类、咪唑类、嘧啶类和吡咯类[6]。DMIs通过抑制14α脱甲基酶，使真菌体内的麦角甾醇生物合成受阻而起到抑菌作用[7]。抑霉唑（imazalil）是DMIs杀菌剂中咪唑类的重要成员，是一种内吸性杀菌剂，该药剂除用于水果、蔬菜和观赏植物的真菌病害的防治外，在防腐、保鲜和延长水果货架期方面，例如预防采后果蔬青霉病和绿霉病也具有卓越的功效[810]。自20世纪70年代抑霉唑在國外被用于柑橘防腐保鲜以来，研究者对其进行了大量研究。目前，该药剂的理化性质、抑菌效率、抑菌效力、毒性试验、残留量测定等均有报道[11]。我国于20世纪80年代初引进抑霉唑制剂，并进行了应用试验[12]，于20世纪90年代开始使用抑霉唑防治柑橘绿霉菌[13]。
抑霉唑因其良好的杀菌和防腐保鲜作用也被广泛用作我国果蔬如葡萄成熟期的杀菌剂和贮藏期的保鲜剂，目前国内外尚无灰葡萄孢对抑霉唑敏感性相关的研究报道，本研究旨在比较葡萄灰霉菌对抑霉唑及其他6种供试药剂的敏感性，探究它们之间是否存在交互抗性，同时检测山东葡萄灰霉菌对其他6种杀菌剂的抗性情况，以期为指导杀菌剂的使用及抗性检测提供依据，减少葡萄成熟期和贮藏期灰霉病导致的损失。
1材料与方法
1.1菌株的采集、分离纯化及保存
2016年从山东蓬莱葡萄主要种植区采集了灰霉病叶和病果样品149份，装入自封袋后用冰袋降温保存。在实验室内对病样进行分离培养，培养基上培养产孢后用接种环蘸取少量孢子进行划线分离培养，1 d后挑取单个分生孢子进行培养，最终纯化得到69株，切取带菌培养基置于冻存管中，加入40%的甘油后保存于-80℃备用。
1.2供试药剂与培养基
97%抑霉唑原药、98%多菌灵原药、98.4%腐霉利原药、97%异菌脲原药、98%咯菌腈原药、97%嘧霉胺原药、98.2%啶酰菌胺原药均由中国农业科学院植物保护研究所农药应用工艺学研究组提供。溶于甲醇或盐酸，配制成20、50、100 mg/mL的母液，密封保存于4℃冰箱备用。
PDA培养基：将土豆去皮、洗净吸干水分然后准确称取200 g，切成厚度1.5 cm的土豆片放入1 L ddH2O中加热煮至熟透。之后用双层纱布过滤，弃滤渣，并用ddH2O将滤液定容到1 L，加入20 g葡萄糖，搅拌至全部溶解后分装于含有3 g琼脂的500 mL锥形瓶中，每瓶定容为300 mL，封口后121℃高压灭菌20 min， 取出后摇匀，室温下保存待用。 1.3葡萄灰霉菌对抑霉唑敏感性测定
采用菌丝生长速率法。抑霉唑的浓度梯度设置为0.5、1、2.5、5、10、20、40 μg/mL，另设置空白对照。使用前先将97%抑霉唑原药溶解于适量甲醇配成20 mg/mL的母液并置于4℃储存待用，试验时按设置浓度稀释，加入到熔化后冷却至50℃左右的PDA培养基中，并根据溶剂含量不得超过培养基总体积的0.5%的标准进行试验。将分离纯化并保存在-80℃的69株灰霉菌活化培养3 d后沿菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼接种到含药PDA平板中央，以不加药的空白PDA平板做对照，每次处理重复3次，置于22℃培养3 d左右，对照组菌落直径达到平板的3/4左右时，用十字交叉法测量菌落直径，利用SPSS 19.0软件计算出抑霉唑对各菌株的EC50。
1.4葡萄灰霉菌对不同杀菌剂的抗药性
采用菌丝生长速率法和孢子萌发法检测葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的抗性频率[14]，根据Bardas等[14]、Myresiotis等[15]的方法，设置多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的最小抑制浓度分别为10、5、5、1、5、1 μg/mL。其中多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺抗药性测定采用菌丝生长速率法。待熔化完全的PDA培养基冷却至50℃加入定量的药剂，制成含药的PDA平板，并设置不含药剂的空白对照。用直径为5 mm打孔器打取活化的灰霉菌株菌落边沿的菌饼，将菌饼菌丝面朝下接种在含药的平板上，置于22℃光照培养箱中培养3 d，观察菌丝生长状况。灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率采用孢子萌发法进行测定：吸取事先制备好的孢子悬浮液均匀涂布在含药WA平板上，22℃培养8～12 h后用显微镜观察孢子的萌发情况。在空白培养基上长势良好，不能在含药培养基上生长或萌发的菌株为敏感菌株，而能在含药培养基上生长或萌发的菌株为抗性菌株。统计敏感和抗性菌株的数量，计算抗性频率。
1.5葡萄灰霉菌对抑霉唑及不同作用机制杀菌剂间的交互抗性
采用菌丝生长速率法测定69株灰霉菌株对多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺的敏感性;采用孢子萌发法测定各菌株对啶酰菌胺的敏感性，设置空白对照。其中使用菌丝生长速率法测定抗药性时，将活化好的菌株打制菌饼接种在含药培养基平板上，22℃培养3 d左右，待对照组菌落直径达到平板的3/4左右后采用十字交叉法测量菌落直径;孢子萌发法则是22℃培养8 h左右，显微镜下随机取3个视野观察100个孢子的萌发数量，计算萌发率。每个处理重复3次。利用SPSS 19.0软件计算出多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺、啶酰菌胺对各菌株的EC50。利用SPSS 19.0软件分析抑霉唑对供试菌株的lgEC50分别与多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺和啶酰菌胺对供试菌株的lgEC50之间的皮尔逊相关性。根据皮尔逊相关系数和显著性来判断两种杀菌剂之间是否存在交互抗性。
2结果与分析
2.1葡萄灰霉菌对不同杀菌剂的抗药性
69株葡萄灰霉菌中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌灵（CarR）、咯菌腈（FluR）、异菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分别为100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%（图1），表明测试菌株已对多菌灵、啶酰菌胺、嘧霉胺产生了完全的抗药性，对腐霉利和异菌脲产生了严重的抗药性，而对咯菌腈的抗性仍较低。对葡萄灰霉菌对这6种杀菌剂的多药抗性分析结果（图2）显示，这69株葡萄灰霉菌株的抗性类型中不存在单抗类型，全部表现为多药抗性，其中BosR_CarR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺）， BosR_CarR_IprR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺）， BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR （抗啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺），BosR_CarR_IprR_PyrR_ProR和 BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR_ProR（抗啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的頻率分别为2.33%， 9.30%，2.33%，79.07%，6.97%，数据显示山东蓬莱地区的葡萄灰霉菌菌群的多药抗性类型中以抗啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利这5种杀菌剂的菌株为主。
2.2抑霉唑对葡萄灰霉菌的EC50测定
采用菌丝生长速率法测定了69株野生葡萄灰霉菌对抑霉唑的敏感性，抑霉唑对各菌株的EC50最高达28.76 μg/mL，最低为0.403 μg/mL，不呈连续性单峰分布，使用SPSS软件进行W法正态性检验，得到W=0.833，P=0.018，P
和对抑霉唑的敏感性，本试验采用菌丝生长速率法和孢子萌发法检测了采自山东蓬莱地区的69株葡萄灰霉菌对上述前6种杀菌剂的抗药性、对抑霉唑的敏感性及抑霉唑与其他6种杀菌剂的交互抗性关系。结果表明，抑霉唑对这69株葡萄灰霉菌的EC50分布在0.403～28.76 μg/mL之间，平均值为（9.34±10.34）μg/mL;葡萄灰霉菌菌株中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌灵（CarR）、咯菌腈（FluR）、异菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分别为100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%，测试菌株的抗药性均为多抗类型，没有单抗菌株，其中对3种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺）、对4种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺）、对5种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利或啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺）和对6种杀菌剂（啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的抗性频率分别为2.33%、9.30%、79.07%、2.33%、6.97%，表明啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺对测试葡萄菌株完全丧失防效，建议在该葡萄产区停止使用这些药剂，测试菌株对腐霉利、异菌脲的抗性频率高，建议采取限制使用、禁止单独使用等措施，测试菌株对咯菌腈的抗性频率较低，可以继续使用但需按照科学使用规则进行。抑霉唑与其他6种杀菌剂间不存在交互抗性关系，说明其可以和其他药剂同时使用但建议减少使用。
关键词葡萄灰霉菌;杀菌剂;抑霉唑;敏感性;抗药性
中图分类号：S 436.631
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018140
灰霉病已经发展成为一种重要的世界性植物真菌类病害，由于其对经济造成严重影响，被列为世界第二大重大植物病原真菌病害[1]。灰霉病发生普遍，在经济作物的田间生长期及采后的贮藏、运输过程中均有发生。其病原真菌灰葡萄孢可引起多种双子叶农作物及包括葡萄在内的多种果蔬的灰霉病。葡萄灰霉病在我国各葡萄主产区均有发生，是葡萄成熟期和贮藏期的重要病害之一，在适宜的低温高湿的环境下极易暴发，影响葡萄品质，造成葡萄严重减产。目前，我国葡萄灰霉病的防控主要以化学防治为主，葡萄生产和贮存上主要使用的药剂包括苯并咪唑类的多菌灵、二甲酰亚胺类的腐霉利和异菌脲、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺、吡咯类的咯菌腈、烟酰胺类的啶酰菌胺、咪唑类的抑霉唑、有机硫类的福美双等。随着这些杀菌剂的高频次和大剂量使用，灰葡萄孢也普遍产生了抗药性甚至多药抗性，造成葡萄生产和贮存上严重的经济损失[2]。据报道，2014年日本大阪地区温室番茄灰霉菌对多菌灵、异菌脲的抗性频率分别达到了74.2%和86.4%[3];2015年中国浙江地区草莓灰霉菌对腐霉利、嘧霉胺的抗性频率分别达到了69.2%和93.7%[4]， 2017年德国东南部树莓灰霉菌对咯菌腈、啶酰菌胺的抗性频率均高达100%[5]。明确病原菌的抗药性及抗药性水平，是选择有效药剂的基础。
14α脱甲基酶抑制剂（14αdemethylation inhibitors， DMIs）类杀菌剂是目前农业上广泛使用的甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂，包含三唑类、咪唑类、嘧啶类和吡咯类[6]。DMIs通过抑制14α脱甲基酶，使真菌体内的麦角甾醇生物合成受阻而起到抑菌作用[7]。抑霉唑（imazalil）是DMIs杀菌剂中咪唑类的重要成员，是一种内吸性杀菌剂，该药剂除用于水果、蔬菜和观赏植物的真菌病害的防治外，在防腐、保鲜和延长水果货架期方面，例如预防采后果蔬青霉病和绿霉病也具有卓越的功效[810]。自20世纪70年代抑霉唑在國外被用于柑橘防腐保鲜以来，研究者对其进行了大量研究。目前，该药剂的理化性质、抑菌效率、抑菌效力、毒性试验、残留量测定等均有报道[11]。我国于20世纪80年代初引进抑霉唑制剂，并进行了应用试验[12]，于20世纪90年代开始使用抑霉唑防治柑橘绿霉菌[13]。
抑霉唑因其良好的杀菌和防腐保鲜作用也被广泛用作我国果蔬如葡萄成熟期的杀菌剂和贮藏期的保鲜剂，目前国内外尚无灰葡萄孢对抑霉唑敏感性相关的研究报道，本研究旨在比较葡萄灰霉菌对抑霉唑及其他6种供试药剂的敏感性，探究它们之间是否存在交互抗性，同时检测山东葡萄灰霉菌对其他6种杀菌剂的抗性情况，以期为指导杀菌剂的使用及抗性检测提供依据，减少葡萄成熟期和贮藏期灰霉病导致的损失。
1材料与方法
1.1菌株的采集、分离纯化及保存
2016年从山东蓬莱葡萄主要种植区采集了灰霉病叶和病果样品149份，装入自封袋后用冰袋降温保存。在实验室内对病样进行分离培养，培养基上培养产孢后用接种环蘸取少量孢子进行划线分离培养，1 d后挑取单个分生孢子进行培养，最终纯化得到69株，切取带菌培养基置于冻存管中，加入40%的甘油后保存于-80℃备用。
1.2供试药剂与培养基
97%抑霉唑原药、98%多菌灵原药、98.4%腐霉利原药、97%异菌脲原药、98%咯菌腈原药、97%嘧霉胺原药、98.2%啶酰菌胺原药均由中国农业科学院植物保护研究所农药应用工艺学研究组提供。溶于甲醇或盐酸，配制成20、50、100 mg/mL的母液，密封保存于4℃冰箱备用。
PDA培养基：将土豆去皮、洗净吸干水分然后准确称取200 g，切成厚度1.5 cm的土豆片放入1 L ddH2O中加热煮至熟透。之后用双层纱布过滤，弃滤渣，并用ddH2O将滤液定容到1 L，加入20 g葡萄糖，搅拌至全部溶解后分装于含有3 g琼脂的500 mL锥形瓶中，每瓶定容为300 mL，封口后121℃高压灭菌20 min， 取出后摇匀，室温下保存待用。 1.3葡萄灰霉菌对抑霉唑敏感性测定
采用菌丝生长速率法。抑霉唑的浓度梯度设置为0.5、1、2.5、5、10、20、40 μg/mL，另设置空白对照。使用前先将97%抑霉唑原药溶解于适量甲醇配成20 mg/mL的母液并置于4℃储存待用，试验时按设置浓度稀释，加入到熔化后冷却至50℃左右的PDA培养基中，并根据溶剂含量不得超过培养基总体积的0.5%的标准进行试验。将分离纯化并保存在-80℃的69株灰霉菌活化培养3 d后沿菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼接种到含药PDA平板中央，以不加药的空白PDA平板做对照，每次处理重复3次，置于22℃培养3 d左右，对照组菌落直径达到平板的3/4左右时，用十字交叉法测量菌落直径，利用SPSS 19.0软件计算出抑霉唑对各菌株的EC50。
1.4葡萄灰霉菌对不同杀菌剂的抗药性
采用菌丝生长速率法和孢子萌发法检测葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的抗性频率[14]，根据Bardas等[14]、Myresiotis等[15]的方法，设置多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的最小抑制浓度分别为10、5、5、1、5、1 μg/mL。其中多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺抗药性测定采用菌丝生长速率法。待熔化完全的PDA培养基冷却至50℃加入定量的药剂，制成含药的PDA平板，并设置不含药剂的空白对照。用直径为5 mm打孔器打取活化的灰霉菌株菌落边沿的菌饼，将菌饼菌丝面朝下接种在含药的平板上，置于22℃光照培养箱中培养3 d，观察菌丝生长状况。灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率采用孢子萌发法进行测定：吸取事先制备好的孢子悬浮液均匀涂布在含药WA平板上，22℃培养8～12 h后用显微镜观察孢子的萌发情况。在空白培养基上长势良好，不能在含药培养基上生长或萌发的菌株为敏感菌株，而能在含药培养基上生长或萌发的菌株为抗性菌株。统计敏感和抗性菌株的数量，计算抗性频率。
1.5葡萄灰霉菌对抑霉唑及不同作用机制杀菌剂间的交互抗性
采用菌丝生长速率法测定69株灰霉菌株对多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺的敏感性;采用孢子萌发法测定各菌株对啶酰菌胺的敏感性，设置空白对照。其中使用菌丝生长速率法测定抗药性时，将活化好的菌株打制菌饼接种在含药培养基平板上，22℃培养3 d左右，待对照组菌落直径达到平板的3/4左右后采用十字交叉法测量菌落直径;孢子萌发法则是22℃培养8 h左右，显微镜下随机取3个视野观察100个孢子的萌发数量，计算萌发率。每个处理重复3次。利用SPSS 19.0软件计算出多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺、啶酰菌胺对各菌株的EC50。利用SPSS 19.0软件分析抑霉唑对供试菌株的lgEC50分别与多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺和啶酰菌胺对供试菌株的lgEC50之间的皮尔逊相关性。根据皮尔逊相关系数和显著性来判断两种杀菌剂之间是否存在交互抗性。
2结果与分析
2.1葡萄灰霉菌对不同杀菌剂的抗药性
69株葡萄灰霉菌中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌灵（CarR）、咯菌腈（FluR）、异菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分别为100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%（图1），表明测试菌株已对多菌灵、啶酰菌胺、嘧霉胺产生了完全的抗药性，对腐霉利和异菌脲产生了严重的抗药性，而对咯菌腈的抗性仍较低。对葡萄灰霉菌对这6种杀菌剂的多药抗性分析结果（图2）显示，这69株葡萄灰霉菌株的抗性类型中不存在单抗类型，全部表现为多药抗性，其中BosR_CarR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺）， BosR_CarR_IprR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺）， BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR （抗啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺），BosR_CarR_IprR_PyrR_ProR和 BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR_ProR（抗啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的頻率分别为2.33%， 9.30%，2.33%，79.07%，6.97%，数据显示山东蓬莱地区的葡萄灰霉菌菌群的多药抗性类型中以抗啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利这5种杀菌剂的菌株为主。
2.2抑霉唑对葡萄灰霉菌的EC50测定
采用菌丝生长速率法测定了69株野生葡萄灰霉菌对抑霉唑的敏感性，抑霉唑对各菌株的EC50最高达28.76 μg/mL，最低为0.403 μg/mL，不呈连续性单峰分布，使用SPSS软件进行W法正态性检验，得到W=0.833，P=0.018，P