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摘要：通过对前处理过程中关键环节进行单因素不同水平比较，选择出同相萃取柱、浓缩方式、氮气流量、水浴温度、质谱参数等因素的最优实验方案，建立一种简便省时及回收效果最佳的前处理流程。采用同相萃取液相色谱一电喷雾串联四极杆质谱法（HPLCIESI-MS）检测微囊藻毒素-LR（MC-LR），选用0.2%甲酸甲醇溶液-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱、选用HLB小柱、普通氮吹仪浓缩（氮气流量1.5L/min、水浴温度38qC）平均回收率为89.3%。质谱优化结果表明：当定量离子质荷比995.8>135锥孔电压49，碰撞能量54；995.8>375.1锥孔电压49，碰撞能量50，MCYST-LR灵敏度高且响应值最大。所建立优化的前处理、检测方法，具有准确度高、灵敏度高、回收率高、分离效果更好的优点，可用于分析水体中痕量MC YST-LR。
关键词：微囊藻毒素-LR；电喷雾；质谱；前处理；优化
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2015） 02-0042-04
引言
蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素，世界上25%～70%的蓝藻水华污染可产生藻毒素；在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素（mlcro-cyslin，MC）是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。另据调查发现，饮用水中MC的存在与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有很大的相关性。MC是一组环状七肽，分子量为1000左右，由于多肽组成中氨基酸种类的变化，导致了该类毒素的多样性，目前已鉴定的异构体有60多种，其命名方式为MC-XZ，MC-LR表示其2，4位分别为亮氨酸（leuc，ine，L）、精氨酸（arginine，R）。
微囊藻毒素在环境水中含量很低，检测干扰大。其检测手段主要有传统的小鼠腹腔注射生物分析法，酶联免疫法，蛋门磷酸酶抑制法等生化分析方法，以及带紫外检测器的高效液相色谱法；国外常利用液相色谱与质谱联用来检测。液相色谱与质谱联用法测定微囊藻毒素不仅能定量，还能够区分MC异构体，但在样品前处理过程中，不同固相萃取柱、淋洗剂、洗脱剂以及浓缩方式都会直接影响微囊藻毒素的回收率。本文建立以固相萃取分离，利用高效液相色谱一电喷雾电离质谱（HPLCIESI-MS）检测微囊藻毒素的方法；研究不同固相萃取柱、浓缩方式、优化氮吹仪参数、优化质谱参数等因素对微囊藻毒素一LR分析结果的影响。
1.实验部分
1.1 仪器和试剂
Wacers高效液相色谱/串联质谱；Masslynx4.0工作站；Zymark全自动固相萃取仪；HLB固相萃取小柱（500mg，6mL）；C18固相萃取小柱（500mg，6mL）；全自动定量氮吹仪；普通氮吹仪。甲醇、甲酸均为色谱纯；水由Millipore纯水机制备；MCYST-LR标样购自Alexs公司。
1.2 液相色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry300，C18柱（4.6mm×75mmx3.5μm，孔径300xl0-10m），柱温：30℃；样品温度：室温，进样体积：10μL，体积流量：0.2mL/min。流动相梯度见表l。
1.3 质谱条件优化
离子源：ESI+，毛细管电压：3.90kV，锥孔电压：49V；离子源温度：100℃，RF透镜1：40.0，光圈：0.0，RF透镜2：0.0，锥孔反吹气体积流量：50L/h，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流量：400L/h，碰撞池压力：3.Oxl0-3Mbar（1bar=105Pa）。
质量分析器：低端分辨率LM Lensl：12.OV，高端分辨率HM Lensl：12.0V，离子能量1：0.3，入口透镜电压：10V，碰撞梯度：1.0，995.8>135碰撞能量：54，995.8>375.1碰撞能量：50，出口电压：12V，低端分辨率LM Lens2：12.OV，高端分辨率HM Lens2：12.OV，离子能量2：0.6。该实验考察了锥孔电压和碰撞能量两个参数的优化，锥孔电压调节值设为36，42，49，52V，定量离子995.8>135碰撞能量调节值设为48，50，54，57；定性离子995.8>375.1碰撞能量调节值设为40，46，50，55，质谱分析时比较对MC-LR检出灵敏度的影响。
1.4 样品前处理的优化
用5mL甲醇、5mL水活化HLB小柱和C18小柱，流量为5 mL/min；取两个空门水样IL，分别加入MC-LR标准100ng，加入5mL甲醇上样至固相萃取小柱，体积流量为4mUmin；用lOmL5%甲醇水溶液淋洗小柱，用氮气吹干10min，然后再用5mL甲醇洗脱两次；合并洗脱液，并用氮吹仪浓缩至lmL，直接进样分析，根据加标回收率的差异比较不同固相萃取小柱的富集效果。
同时取4个空门水样，分别加入MC-LR标准100ng，采用固相萃取获得有机相后，同时利用全自动型氮吹仪和普通氮吹仪两种浓缩方式，氮吹过程中多次用滴管涮洗氮吹瓶内壁，最终浓缩定容至lmL，直接进样分析，对比不同浓缩方式对回收率的影响。
取空门水样分别加入MC-LR标准100ng，固相萃取后采用普通氮吹浓缩样品，调节一定的水浴温度，同时缓慢吹入氮气吹脱进行浓缩。氮气体积流量设为0.5，1，1.5，2L/min；水浴温度设为36，37，38，40℃；浓缩定容至lmL直接进样分析，对比不同氮气流量和水浴温度对回收率的影响。
2.结果与讨论
2.1 不同固相萃取柱对微囊藻毒素测定结果的影响
采用硅胶键合Sep-Pak C18和以聚合物为填料的Oasis HLB两种小柱富集微囊藻毒素，按照上述1.4方法进行样品前处理，比较两种小柱的富集效果。结果表明，Oasis HLB小柱回收率与Sep-PakC18小柱相比提高了20%～25%。由此可见，两种小柱的富集效果有明显差异，对于极性强的MC-LR，Oasis HLB小柱的富集效率显著高于Sep-Pak C18小柱；因为HLB小柱的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有较大的吸附容量；与C18小柱相比，同样容量规格的HLB小柱吸附剂的表面积增大2～3倍，对极性强的MC-LR富集效率就更高。鉴于HLB固相萃取柱操作简便、快速，并具有较大吸附能力，所以本方法采用HLB柱。 2.2 不同浓缩方式对MCYST-LR回收率的影响
该研究采用固相萃取获得有机相后，用普通氮吹代替全自动氮吹，按照上述样品前处理方法1.4进行分析。取4个空门水样500mL，分别加入MC-LR标准品100ng、200ng，考察手动氮吹仪和全自动型氮吹仪两种浓缩方式对MCYST-LR回收率的影响，见图1。由图可见，采用普通氮吹浓缩，微囊藻毒素回收效果更佳，相对于全自动型氮吹，用滴管涮洗氮吹瓶内壁是关键步骤，很大程度地减少了待测组分的损失，提高了回收率。
2.3 优化氮吹仪参数
本文采用普通氮吹浓缩样品，调节一定的水浴温度，同时缓慢吹入氮气吹脱进行浓缩按照上述样品前处理方法1.4进行分析。实验考察了氮气流量和水浴温度两个参数对MCYST-LR回收率的影响，结果见图2与图3。氮吹浓缩时，氮气体积流量允许范围为0.5～2.0L/min，加热的原则是增加溶剂挥发速度的同时尽量保证目标物的保留，水浴温度范围为36-40℃。由图可知，氮气体积流量调节为1.5Lmin，水浴温度调节为38℃，回收效果更佳，该实验通过优化这两个参数，回收率明显提高，因为氮气压力降低，水浴温度略微降低，减少目标化合物在浓缩过程中的损失，但是氮气压力不能过低，压力过低会延长浓缩样品的时间。
2.4 锥孔电压和碰撞能量对MCYST-LR灵敏度
的影响
根据各种MCYST分子结构，选择ESI（+）作为电离化模式，将MCYST-LR标准品分别配制成lμg/mL的甲醇溶液，通过全扫描方式找出其母离子m/z995.8，使用Daughter扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子丰度逐渐减少，子离子丰度逐渐增加。选碎片离子m/z135作为LR的定量离子，m/z375.1作为LR的定性离子，最后在MRM方式中进一步调整碰撞能量，确定其最佳诱导碰撞能量的范围。实验考察了锥孔电压和碰撞能量两个参数对MCYST-LR检测灵敏度的影响，结果如表2所示。
由表2可知，定量离子995.8>135锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为54时；定性离子995.8>375.1锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为50时，MCYST-LR灵敏度更高，响应值最大。
3.结束语
由上述结果可以看出，前处理方法和质谱参数的优化对微囊藻毒素-LR测定的影响非常显著，与C18小柱相比，同样容量规格的HLB小柱吸附剂的表面积增大2～3倍，对极性强的MC-LR富集效卒就更高；浓缩方式采用普通氮吹仪回收效果更佳；氮吹浓缩时氮气体积流量调节为1.5L/min，水浴温度调节为38℃，回收效果较好；质谱参数优化，锥孔电压和碰撞能量这两个参数对微囊藻毒素-LR检测灵敏度的影响较显著，优化后定量离子995.8>135锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为54时；定性离子995.8>375.1锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为50时，MCYST-LR灵敏度更高，响应值最大。
本文考察了浓缩方式、固相萃取柱、氮吹过程中的参数、质谱参数等前处理方法中涉及的因素比较，提出优化措施，使整个检测过程更为实用简便，同时显著提高了微囊藻毒素-LR的回收率。应用优化后的微囊藻毒素-LR前处理条件和液相色谱联用电离质谱法检测，能够取得更为理想的分析效果，对于微囊藻毒素-LR液相色谱联用质谱检测技术的推广应用具有重要参考价值。
关键词：微囊藻毒素-LR；电喷雾；质谱；前处理；优化
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2015） 02-0042-04
引言
蓝藻水华污染所带来的主要危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的藻毒素，世界上25%～70%的蓝藻水华污染可产生藻毒素；在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素（mlcro-cyslin，MC）是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。另据调查发现，饮用水中MC的存在与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有很大的相关性。MC是一组环状七肽，分子量为1000左右，由于多肽组成中氨基酸种类的变化，导致了该类毒素的多样性，目前已鉴定的异构体有60多种，其命名方式为MC-XZ，MC-LR表示其2，4位分别为亮氨酸（leuc，ine，L）、精氨酸（arginine，R）。
微囊藻毒素在环境水中含量很低，检测干扰大。其检测手段主要有传统的小鼠腹腔注射生物分析法，酶联免疫法，蛋门磷酸酶抑制法等生化分析方法，以及带紫外检测器的高效液相色谱法；国外常利用液相色谱与质谱联用来检测。液相色谱与质谱联用法测定微囊藻毒素不仅能定量，还能够区分MC异构体，但在样品前处理过程中，不同固相萃取柱、淋洗剂、洗脱剂以及浓缩方式都会直接影响微囊藻毒素的回收率。本文建立以固相萃取分离，利用高效液相色谱一电喷雾电离质谱（HPLCIESI-MS）检测微囊藻毒素的方法；研究不同固相萃取柱、浓缩方式、优化氮吹仪参数、优化质谱参数等因素对微囊藻毒素一LR分析结果的影响。
1.实验部分
1.1 仪器和试剂
Wacers高效液相色谱/串联质谱；Masslynx4.0工作站；Zymark全自动固相萃取仪；HLB固相萃取小柱（500mg，6mL）；C18固相萃取小柱（500mg，6mL）；全自动定量氮吹仪；普通氮吹仪。甲醇、甲酸均为色谱纯；水由Millipore纯水机制备；MCYST-LR标样购自Alexs公司。
1.2 液相色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry300，C18柱（4.6mm×75mmx3.5μm，孔径300xl0-10m），柱温：30℃；样品温度：室温，进样体积：10μL，体积流量：0.2mL/min。流动相梯度见表l。
1.3 质谱条件优化
离子源：ESI+，毛细管电压：3.90kV，锥孔电压：49V；离子源温度：100℃，RF透镜1：40.0，光圈：0.0，RF透镜2：0.0，锥孔反吹气体积流量：50L/h，脱溶剂气温度：350℃，脱溶剂气流量：400L/h，碰撞池压力：3.Oxl0-3Mbar（1bar=105Pa）。
质量分析器：低端分辨率LM Lensl：12.OV，高端分辨率HM Lensl：12.0V，离子能量1：0.3，入口透镜电压：10V，碰撞梯度：1.0，995.8>135碰撞能量：54，995.8>375.1碰撞能量：50，出口电压：12V，低端分辨率LM Lens2：12.OV，高端分辨率HM Lens2：12.OV，离子能量2：0.6。该实验考察了锥孔电压和碰撞能量两个参数的优化，锥孔电压调节值设为36，42，49，52V，定量离子995.8>135碰撞能量调节值设为48，50，54，57；定性离子995.8>375.1碰撞能量调节值设为40，46，50，55，质谱分析时比较对MC-LR检出灵敏度的影响。
1.4 样品前处理的优化
用5mL甲醇、5mL水活化HLB小柱和C18小柱，流量为5 mL/min；取两个空门水样IL，分别加入MC-LR标准100ng，加入5mL甲醇上样至固相萃取小柱，体积流量为4mUmin；用lOmL5%甲醇水溶液淋洗小柱，用氮气吹干10min，然后再用5mL甲醇洗脱两次；合并洗脱液，并用氮吹仪浓缩至lmL，直接进样分析，根据加标回收率的差异比较不同固相萃取小柱的富集效果。
同时取4个空门水样，分别加入MC-LR标准100ng，采用固相萃取获得有机相后，同时利用全自动型氮吹仪和普通氮吹仪两种浓缩方式，氮吹过程中多次用滴管涮洗氮吹瓶内壁，最终浓缩定容至lmL，直接进样分析，对比不同浓缩方式对回收率的影响。
取空门水样分别加入MC-LR标准100ng，固相萃取后采用普通氮吹浓缩样品，调节一定的水浴温度，同时缓慢吹入氮气吹脱进行浓缩。氮气体积流量设为0.5，1，1.5，2L/min；水浴温度设为36，37，38，40℃；浓缩定容至lmL直接进样分析，对比不同氮气流量和水浴温度对回收率的影响。
2.结果与讨论
2.1 不同固相萃取柱对微囊藻毒素测定结果的影响
采用硅胶键合Sep-Pak C18和以聚合物为填料的Oasis HLB两种小柱富集微囊藻毒素，按照上述1.4方法进行样品前处理，比较两种小柱的富集效果。结果表明，Oasis HLB小柱回收率与Sep-PakC18小柱相比提高了20%～25%。由此可见，两种小柱的富集效果有明显差异，对于极性强的MC-LR，Oasis HLB小柱的富集效率显著高于Sep-Pak C18小柱；因为HLB小柱的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有较大的吸附容量；与C18小柱相比，同样容量规格的HLB小柱吸附剂的表面积增大2～3倍，对极性强的MC-LR富集效率就更高。鉴于HLB固相萃取柱操作简便、快速，并具有较大吸附能力，所以本方法采用HLB柱。 2.2 不同浓缩方式对MCYST-LR回收率的影响
该研究采用固相萃取获得有机相后，用普通氮吹代替全自动氮吹，按照上述样品前处理方法1.4进行分析。取4个空门水样500mL，分别加入MC-LR标准品100ng、200ng，考察手动氮吹仪和全自动型氮吹仪两种浓缩方式对MCYST-LR回收率的影响，见图1。由图可见，采用普通氮吹浓缩，微囊藻毒素回收效果更佳，相对于全自动型氮吹，用滴管涮洗氮吹瓶内壁是关键步骤，很大程度地减少了待测组分的损失，提高了回收率。
2.3 优化氮吹仪参数
本文采用普通氮吹浓缩样品，调节一定的水浴温度，同时缓慢吹入氮气吹脱进行浓缩按照上述样品前处理方法1.4进行分析。实验考察了氮气流量和水浴温度两个参数对MCYST-LR回收率的影响，结果见图2与图3。氮吹浓缩时，氮气体积流量允许范围为0.5～2.0L/min，加热的原则是增加溶剂挥发速度的同时尽量保证目标物的保留，水浴温度范围为36-40℃。由图可知，氮气体积流量调节为1.5Lmin，水浴温度调节为38℃，回收效果更佳，该实验通过优化这两个参数，回收率明显提高，因为氮气压力降低，水浴温度略微降低，减少目标化合物在浓缩过程中的损失，但是氮气压力不能过低，压力过低会延长浓缩样品的时间。
2.4 锥孔电压和碰撞能量对MCYST-LR灵敏度
的影响
根据各种MCYST分子结构，选择ESI（+）作为电离化模式，将MCYST-LR标准品分别配制成lμg/mL的甲醇溶液，通过全扫描方式找出其母离子m/z995.8，使用Daughter扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子丰度逐渐减少，子离子丰度逐渐增加。选碎片离子m/z135作为LR的定量离子，m/z375.1作为LR的定性离子，最后在MRM方式中进一步调整碰撞能量，确定其最佳诱导碰撞能量的范围。实验考察了锥孔电压和碰撞能量两个参数对MCYST-LR检测灵敏度的影响，结果如表2所示。
由表2可知，定量离子995.8>135锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为54时；定性离子995.8>375.1锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为50时，MCYST-LR灵敏度更高，响应值最大。
3.结束语
由上述结果可以看出，前处理方法和质谱参数的优化对微囊藻毒素-LR测定的影响非常显著，与C18小柱相比，同样容量规格的HLB小柱吸附剂的表面积增大2～3倍，对极性强的MC-LR富集效卒就更高；浓缩方式采用普通氮吹仪回收效果更佳；氮吹浓缩时氮气体积流量调节为1.5L/min，水浴温度调节为38℃，回收效果较好；质谱参数优化，锥孔电压和碰撞能量这两个参数对微囊藻毒素-LR检测灵敏度的影响较显著，优化后定量离子995.8>135锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为54时；定性离子995.8>375.1锥孔电压调节为49，碰撞能量调节为50时，MCYST-LR灵敏度更高，响应值最大。
本文考察了浓缩方式、固相萃取柱、氮吹过程中的参数、质谱参数等前处理方法中涉及的因素比较，提出优化措施，使整个检测过程更为实用简便，同时显著提高了微囊藻毒素-LR的回收率。应用优化后的微囊藻毒素-LR前处理条件和液相色谱联用电离质谱法检测，能够取得更为理想的分析效果，对于微囊藻毒素-LR液相色谱联用质谱检测技术的推广应用具有重要参考价值。