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摘要：白条天牛属的天牛是一类严重危害多种林木的蛀干害虫。为了丰富白条天牛属线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因数据库，探索该属各种类的系统发育关系，以利于用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因作DNA条形码快速准确地鉴定白条天牛种类。应用PCR技术扩增3种白条天牛标本的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列，并与GenBank记录的4种白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列进行比对，以分析其序列组成变异及碱基替换规律，最后利用MEGA 5.0构建系统进化树。结果显示，白条天牛的亲缘关系与地理分布有关，同一国家的白条天牛之间的亲缘关系较近，不同国家的白条天牛之间的亲缘关系较远。
关键词：白条天牛；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因；基因条形码；系统发育关系
中图分类号： S433.5文献标志码： A[HK]
文章编号：1002-1302（2017）13-0090-04[HS）][HT9.SS]
收稿日期：2016-03-18
基金项目：江苏省出入境检验检疫局科技计划项目（编号：2014KJ48）。
作者简介：禹海鑫（1984—），男，河南泌阳人，博士，农艺师，主要从事植物检疫、昆虫分类和昆虫分子化学生态学研究。Tel：（0513）68588180；E-mail：[email protected]。
[ZK）]
沟胫天牛亚科（Laniinae）隶属于鞘翅目（Cleoptera）天牛科（Cerambycidae），是天牛科种类数目最多的一个亚科，全世界已知种类大约20 000种。其中白条天牛属（Batocera）昆虫是该亚科内十分重要的一类林木害虫，它的幼虫钻蛀取食树木的树干及枝条的木质部、韧皮部，可危害柳树、苹果树、栎树、杨树等多个阔叶树种，给农林业生产造成极大的经济损失[1-2]。全世界白条天牛种类约有60种，广泛分布在非洲、澳大利亚、亚洲和东欧地区。我国约有12种，包括锈斑白条天牛（B. numitor Newman）、麻栎白条天牛（B. quercinea Wang et Zhang）等[2-3]。除上述12种外，余下约50种在我国是没有分布的，被2007年发布的《进境植物检疫性有害生物名录》列为我国检疫性昆虫[2]。
近年来，随着我国外向型经济的持续发展，原木和木质包装进出口数量剧增，我国多个口岸在进境木材检疫查验中截获了白条天牛。例如，2009年乍浦口岸检疫人员从马来西亚进境原木中首次截获托氏白条天牛（B. thomsoni）[4]。2012年张家港口岸从巴布亚新几内亚原木中截获白条天牛B. laena[5]。另据相关媒体报道，2013年张家港口岸从非洲原木中截获到白条天牛B. wyllei[6]。2014年，吴江口岸在进境原木中截获了婆罗白条天牛（B. tigris）[7]。
目前，昆虫种类鉴定以形态学鉴定为主，但可用于形态比较的特征数量有限且不稳定，同时国门口岸截获的昆虫往往是以卵、幼虫、蛹或肢体残缺虫态出现，传统的形态学鉴定方法显然不适用[8]；因此，需要探索新方法来解决传统形态学鉴定中遇到的困境。随着分子试验技术的迅猛发展，利用DNA序列研究遗传进化、系统发育及种类鉴定已经成为昆虫学研究的热点。其中，基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA COⅠ）基因序列的DNA条形码技术是当前相对成熟的分子鉴定技术[9]。花婧等通过此技术对大小蠹属17个种进行了分子鉴定[10]。Stauffer等利用该技术，实现了对欧洲7种齿小蠹的快速鉴定[11]。
本研究对已获得的6种白条天牛的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段进行测序和对比，分析这些CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列（即DNA条形码）的特征及遗传系统发育关系，以获得能准确鉴定白条天牛种类的分子方法，为研究其他天牛种类的分子鉴定方法提供有益参考[12]。
1材料与方法
1.1昆虫标本
本试验所用的标本由南通出入境检验检疫局有害生物检疫实验室提供，包括锈斑白条天牛（B. davidis）、橙斑白条天牛（B. numitor）、印尼白条天牛（B. celebiana）3种白条天牛，所有天牛标本均经国内天牛专家安榆林研究员鉴定。标本来源与采集时间如表1所示。另外，从GenBank网站获得4种白条天牛共7条CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列（表2）用于比对。其中，印尼白条天牛（B. celebiana）是在我国没有分布的国外种类，余下3种天牛在我国均有分布。
1.2提取基因组DNA
采用从北京金麦格生物技术有限公司购买的GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取各样品的基因组DNA。提取方法：用双蒸水冲洗100%乙醇浸泡的天牛肌肉组织（应少于30 mg），转入1.5 mL离心管中，置于MM400球磨仪研磨30 s（30次/s）后，12 000 r/min离心 10 min。离心后加180 mL裂解缓冲液及20 mL Proteinase K，于55 ℃水中温浴10 min。再加200 mL无水乙醇、200 mL缓冲液、20 mL磁珠，用磁珠来吸附基因组DNA，然后加 500 mL Wash Buffer去雜。最后加20 μL Elution Buffer，静置5 min后洗脱磁珠即得样品的基因组DNA溶液[10，13]。
1.3CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]片段扩增和测序
在ProFlexTM PCR仪（购自ABI公司）上进行PCR反应。反应采用25 μL体系，其中2 μL MgCl2（25 mmol/L），2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）（购自TaKaRa公司），上、下游引物（10 μmol/L）（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）各0.5 μL，加灭菌水至25 μL。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃保持1 min，设置35个循环；最后在 72 ℃ 下延伸10 min。反应完毕将PCR产物送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序[13-14]。本试验PCR反应采用巢式PCR，第1轮反应引物为F1、R1，第2轮PCR引物为F2、R2[13]，各引物序列如表3所示。本试验利用巢式PCR既降低了扩出多个非目标基因条带的可能性，也提高了PCR检测的准确度和灵敏度 1.4序列分析和建树
将测得的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列导入SeqMan分析软件中进行拼接及校正[16]。利用NCBI中的Blast工具搜索相似性序列，以确认序列的方向和可信度。再将所测序列与从GenBank上获得的白条天牛序列共同载入Clustal X 1.83软件中进行比对[17]。将序列比对结果导入MEGA 5.05软件中[18]算出白条天牛种类间的转换/颠换（R）、变异位点（V）、保守位点（C）等[12，14]。最后使用MEGA 5.05软件采用邻接法构建系统发育树，重复1 000次。
2结果与分析
2.1DNA凝胶电泳结果
本试验对3种白条天牛样品基因组DNA进行巢式PCR扩增，结果（图1）表明，3个样品在525 bp处均有清晰明亮、特异性好的条带，且没有非特异性条带出现，可满足后续基因测序的需要。
2.2白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列解析
2.2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列特征
将各序列导入MEGA 5.05软件，均切成同等长度（434 bp）的片段[15]。结果发现，共有变异位点、保守位点、自裔位点和简约信息位点分别为314、120、117、195个。另外，统计所有位点碱基的平均含量，结果显示，A的平均含量为29.5%，T的平均含量为33.8%，G的平均含量为19.0%，C的平均含量为17.7%[12-14]。其中，A和T的含量相当，且A T的含量为63.3%，明显高于G C的含量（36.7%），显示出了显著的A T碱基偏嗜。这也与昆虫线粒体基因各碱基组成的基本规律相吻合[15，19]。
2.2.2碱基替换规律分析
用MEGA 5.05软件分析序列各位点碱基替换规律[20]，结果（表4）表明，位点转换主要出现在C与T之间，颠换主要出现在T与A之间，R的平均值为0.78。对密码子各位点研究发现，在第2位点上易发生转换和颠换，且转换值与颠换值相近（R=0.77）。此外，第1、第3位点的R值分别为0.67、0.91。此结果表明，序列各位点R值均小于2，说明该序列转换与颠换未达饱和，构建系统发育树要充分考虑转换和颠换的发生比率。
2.2.4建立系统发育树
利用MEGA 5.05软件建立白条天牛属系统发育树，由图3可知，B. horsfieldi 1与B. horsfieldi 2聚为一小支，且与B. horsfieldi 3聚为一支；B. lineolata 1与B. lineolata 2聚为一小支。说明同种类白条天牛个体间均可[FL）]
[FK（W51][TPYHX2.tif][FK）]
[FL（2K2]以分别聚为一支，因此，同种类白条天牛可以和其他种类白条天牛较好地区分开来，这也与形态学鉴定结果一致。从整体上看，我国已有分布的5种（8头）白条天牛B. rubus、B. horsfieldi、B. davidis、 B.lineolata、B.numitor聚为一大支，而我国尚未有分布的1种（2头）白条天牛B.celebiana聚为一支，2支亲缘关系较远，互为姊妹群。结果表明，白条天牛的亲缘关系与地理分布有关，同一国家白条天牛种类之间的亲缘关系较近，但与其他国家白条天牛种类之间的亲缘关系较远。
3结论与讨论
线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因含有较多既相对保守又有足够变异的遗传信息位点，常被当作DNA条形码用于物种鉴定及系统发育学研究中[21]。黄丽莉等利用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因实现了对6个不同地理种群茶黄蓟马与其他4种常见蓟马的快速鉴定[22]。李京通过对天牛科66种天牛线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列特征及系统发育的研究，初步弄清楚了各类群间亲缘关系的远近[23]。郑丝竹也对天牛科5亚科160种天牛进行了CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列特征数据库构建，并由此建立了160种天牛快速分子鉴定的技术体系[24]。
近年来，随着我国外向型经济水平的持续提升，各口岸进出口货物量剧增。我国口岸从进口货物中截获的天牛科昆虫种类、数量增多，但这些天牛多以卵、幼虫及蛹虫态和肢体残缺的成虫等形态出现，用传统的形态学方法鉴定存在较大困难。用线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段作DNA条形码用于昆虫种类的分子鉴定，极大程度上克服了传统形态学鉴定的缺陷[25]；但是，目前该方法在白条天牛种类鉴定中的应用还未见报道。
本研究通过对3种白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列与GenBank中已公开的白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列进行比对分析，发現该序列既可有效区分白条天牛种类，又能提供丰富的物种亲缘关系信息。建立的系统发育进化树中包含的信息与传统的形态学鉴定结果相符，同时也证实了白条天牛种类间的亲缘关系与地理分布有关。本试验的结果不仅对白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的数据库进行了补充和完善，也为下一步将CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因分析方法应用于口岸多种检疫性天牛的种类鉴定及系统发育学研究提供基础。值得关注的是，由于不同的基因含有不同的遗传进化信息，也具有不同的遗传进化速率，因此，在后续的检疫性天牛系统发育学研究中，为了得到更精确的系统发育进化树，还需要在结合多个基因分析、多种成虫、幼虫形态特征及多种建树方法等方面努力。
[HS2]参考文献：
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关键词：白条天牛；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因；基因条形码；系统发育关系
中图分类号： S433.5文献标志码： A[HK]
文章编号：1002-1302（2017）13-0090-04[HS）][HT9.SS]
收稿日期：2016-03-18
基金项目：江苏省出入境检验检疫局科技计划项目（编号：2014KJ48）。
作者简介：禹海鑫（1984—），男，河南泌阳人，博士，农艺师，主要从事植物检疫、昆虫分类和昆虫分子化学生态学研究。Tel：（0513）68588180；E-mail：[email protected]。
[ZK）]
沟胫天牛亚科（Laniinae）隶属于鞘翅目（Cleoptera）天牛科（Cerambycidae），是天牛科种类数目最多的一个亚科，全世界已知种类大约20 000种。其中白条天牛属（Batocera）昆虫是该亚科内十分重要的一类林木害虫，它的幼虫钻蛀取食树木的树干及枝条的木质部、韧皮部，可危害柳树、苹果树、栎树、杨树等多个阔叶树种，给农林业生产造成极大的经济损失[1-2]。全世界白条天牛种类约有60种，广泛分布在非洲、澳大利亚、亚洲和东欧地区。我国约有12种，包括锈斑白条天牛（B. numitor Newman）、麻栎白条天牛（B. quercinea Wang et Zhang）等[2-3]。除上述12种外，余下约50种在我国是没有分布的，被2007年发布的《进境植物检疫性有害生物名录》列为我国检疫性昆虫[2]。
近年来，随着我国外向型经济的持续发展，原木和木质包装进出口数量剧增，我国多个口岸在进境木材检疫查验中截获了白条天牛。例如，2009年乍浦口岸检疫人员从马来西亚进境原木中首次截获托氏白条天牛（B. thomsoni）[4]。2012年张家港口岸从巴布亚新几内亚原木中截获白条天牛B. laena[5]。另据相关媒体报道，2013年张家港口岸从非洲原木中截获到白条天牛B. wyllei[6]。2014年，吴江口岸在进境原木中截获了婆罗白条天牛（B. tigris）[7]。
目前，昆虫种类鉴定以形态学鉴定为主，但可用于形态比较的特征数量有限且不稳定，同时国门口岸截获的昆虫往往是以卵、幼虫、蛹或肢体残缺虫态出现，传统的形态学鉴定方法显然不适用[8]；因此，需要探索新方法来解决传统形态学鉴定中遇到的困境。随着分子试验技术的迅猛发展，利用DNA序列研究遗传进化、系统发育及种类鉴定已经成为昆虫学研究的热点。其中，基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA COⅠ）基因序列的DNA条形码技术是当前相对成熟的分子鉴定技术[9]。花婧等通过此技术对大小蠹属17个种进行了分子鉴定[10]。Stauffer等利用该技术，实现了对欧洲7种齿小蠹的快速鉴定[11]。
本研究对已获得的6种白条天牛的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段进行测序和对比，分析这些CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列（即DNA条形码）的特征及遗传系统发育关系，以获得能准确鉴定白条天牛种类的分子方法，为研究其他天牛种类的分子鉴定方法提供有益参考[12]。
1材料与方法
1.1昆虫标本
本试验所用的标本由南通出入境检验检疫局有害生物检疫实验室提供，包括锈斑白条天牛（B. davidis）、橙斑白条天牛（B. numitor）、印尼白条天牛（B. celebiana）3种白条天牛，所有天牛标本均经国内天牛专家安榆林研究员鉴定。标本来源与采集时间如表1所示。另外，从GenBank网站获得4种白条天牛共7条CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列（表2）用于比对。其中，印尼白条天牛（B. celebiana）是在我国没有分布的国外种类，余下3种天牛在我国均有分布。
1.2提取基因组DNA
采用从北京金麦格生物技术有限公司购买的GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取各样品的基因组DNA。提取方法：用双蒸水冲洗100%乙醇浸泡的天牛肌肉组织（应少于30 mg），转入1.5 mL离心管中，置于MM400球磨仪研磨30 s（30次/s）后，12 000 r/min离心 10 min。离心后加180 mL裂解缓冲液及20 mL Proteinase K，于55 ℃水中温浴10 min。再加200 mL无水乙醇、200 mL缓冲液、20 mL磁珠，用磁珠来吸附基因组DNA，然后加 500 mL Wash Buffer去雜。最后加20 μL Elution Buffer，静置5 min后洗脱磁珠即得样品的基因组DNA溶液[10，13]。
1.3CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]片段扩增和测序
在ProFlexTM PCR仪（购自ABI公司）上进行PCR反应。反应采用25 μL体系，其中2 μL MgCl2（25 mmol/L），2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）（购自TaKaRa公司），上、下游引物（10 μmol/L）（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）各0.5 μL，加灭菌水至25 μL。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃保持1 min，设置35个循环；最后在 72 ℃ 下延伸10 min。反应完毕将PCR产物送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序[13-14]。本试验PCR反应采用巢式PCR，第1轮反应引物为F1、R1，第2轮PCR引物为F2、R2[13]，各引物序列如表3所示。本试验利用巢式PCR既降低了扩出多个非目标基因条带的可能性，也提高了PCR检测的准确度和灵敏度 1.4序列分析和建树
将测得的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列导入SeqMan分析软件中进行拼接及校正[16]。利用NCBI中的Blast工具搜索相似性序列，以确认序列的方向和可信度。再将所测序列与从GenBank上获得的白条天牛序列共同载入Clustal X 1.83软件中进行比对[17]。将序列比对结果导入MEGA 5.05软件中[18]算出白条天牛种类间的转换/颠换（R）、变异位点（V）、保守位点（C）等[12，14]。最后使用MEGA 5.05软件采用邻接法构建系统发育树，重复1 000次。
2结果与分析
2.1DNA凝胶电泳结果
本试验对3种白条天牛样品基因组DNA进行巢式PCR扩增，结果（图1）表明，3个样品在525 bp处均有清晰明亮、特异性好的条带，且没有非特异性条带出现，可满足后续基因测序的需要。
2.2白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列解析
2.2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列特征
将各序列导入MEGA 5.05软件，均切成同等长度（434 bp）的片段[15]。结果发现，共有变异位点、保守位点、自裔位点和简约信息位点分别为314、120、117、195个。另外，统计所有位点碱基的平均含量，结果显示，A的平均含量为29.5%，T的平均含量为33.8%，G的平均含量为19.0%，C的平均含量为17.7%[12-14]。其中，A和T的含量相当，且A T的含量为63.3%，明显高于G C的含量（36.7%），显示出了显著的A T碱基偏嗜。这也与昆虫线粒体基因各碱基组成的基本规律相吻合[15，19]。
2.2.2碱基替换规律分析
用MEGA 5.05软件分析序列各位点碱基替换规律[20]，结果（表4）表明，位点转换主要出现在C与T之间，颠换主要出现在T与A之间，R的平均值为0.78。对密码子各位点研究发现，在第2位点上易发生转换和颠换，且转换值与颠换值相近（R=0.77）。此外，第1、第3位点的R值分别为0.67、0.91。此结果表明，序列各位点R值均小于2，说明该序列转换与颠换未达饱和，构建系统发育树要充分考虑转换和颠换的发生比率。
2.2.4建立系统发育树
利用MEGA 5.05软件建立白条天牛属系统发育树，由图3可知，B. horsfieldi 1与B. horsfieldi 2聚为一小支，且与B. horsfieldi 3聚为一支；B. lineolata 1与B. lineolata 2聚为一小支。说明同种类白条天牛个体间均可[FL）]
[FK（W51][TPYHX2.tif][FK）]
[FL（2K2]以分别聚为一支，因此，同种类白条天牛可以和其他种类白条天牛较好地区分开来，这也与形态学鉴定结果一致。从整体上看，我国已有分布的5种（8头）白条天牛B. rubus、B. horsfieldi、B. davidis、 B.lineolata、B.numitor聚为一大支，而我国尚未有分布的1种（2头）白条天牛B.celebiana聚为一支，2支亲缘关系较远，互为姊妹群。结果表明，白条天牛的亲缘关系与地理分布有关，同一国家白条天牛种类之间的亲缘关系较近，但与其他国家白条天牛种类之间的亲缘关系较远。
3结论与讨论
线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因含有较多既相对保守又有足够变异的遗传信息位点，常被当作DNA条形码用于物种鉴定及系统发育学研究中[21]。黄丽莉等利用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因实现了对6个不同地理种群茶黄蓟马与其他4种常见蓟马的快速鉴定[22]。李京通过对天牛科66种天牛线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列特征及系统发育的研究，初步弄清楚了各类群间亲缘关系的远近[23]。郑丝竹也对天牛科5亚科160种天牛进行了CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列特征数据库构建，并由此建立了160种天牛快速分子鉴定的技术体系[24]。
近年来，随着我国外向型经济水平的持续提升，各口岸进出口货物量剧增。我国口岸从进口货物中截获的天牛科昆虫种类、数量增多，但这些天牛多以卵、幼虫及蛹虫态和肢体残缺的成虫等形态出现，用传统的形态学方法鉴定存在较大困难。用线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段作DNA条形码用于昆虫种类的分子鉴定，极大程度上克服了传统形态学鉴定的缺陷[25]；但是，目前该方法在白条天牛种类鉴定中的应用还未见报道。
本研究通过对3种白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列与GenBank中已公开的白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列进行比对分析，发現该序列既可有效区分白条天牛种类，又能提供丰富的物种亲缘关系信息。建立的系统发育进化树中包含的信息与传统的形态学鉴定结果相符，同时也证实了白条天牛种类间的亲缘关系与地理分布有关。本试验的结果不仅对白条天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的数据库进行了补充和完善，也为下一步将CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因分析方法应用于口岸多种检疫性天牛的种类鉴定及系统发育学研究提供基础。值得关注的是，由于不同的基因含有不同的遗传进化信息，也具有不同的遗传进化速率，因此，在后续的检疫性天牛系统发育学研究中，为了得到更精确的系统发育进化树，还需要在结合多个基因分析、多种成虫、幼虫形态特征及多种建树方法等方面努力。
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