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摘要：目的 建立颈椎康复丸质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中丹参、香附进行定性鉴别。采用高效液相色谱法对制剂中白芍的有效成分芍药苷进行含量测定。Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱，乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长230 nm。结果 丹参、香附的薄层鉴别专属性强，重复性良好。芍药苷在0.202 884～1.014 42 ?g范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为98.79%， RSD=0.865%（n=5）。结论 本方法能很好地控制产品的质量，有利于颈椎康复丸质量的提升。
关键词：颈椎康复丸；芍药苷；高效液相色谱法；薄层色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）08-0059-02
颈椎康复丸为首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，是由白芍、丹参、香附等药物组成的水丸剂型，具有平肝柔筋、行气祛湿、补益肝肾之功效，临床用于肝气不舒、风寒湿痹所致肝肾不足之各种类型眩晕无力、手麻肩痛、酸胀活动受限等症状。为有效控制药品质量，保证临床用药的安全有效，笔者对其质量标准进行了研究，采用薄层色谱法（TLC）对丹参、香附进行定性鉴别研究，采用高效液相色谱法（HPLC）测定白芍的有效成分芍药苷的含量，为颈椎康复丸的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪Agilent1200，AL204型电子天平（METTLER TOLEDO），超声波清洗器（AS20500BDT），暗箱式紫外分析仪（ZF-20D），薄层色谱硅胶预制板SGF254板（烟台市化学工业研究所），点样器，展开容器，显色装置。
芍药苷对照品（批号110736-200934，含量95.7%），α-香附酮对照品（批号110748-200709，含量100%），丹参对照药材（批号120923-200912），均购自中国药品生物制品检定所。颈椎康复丸（首都医科大学附属北京中医医院委托北京勃然制药有限公司加工，批准文号：京药制字Z20053283），批号080722、081214、090830、091227、100528、100913、110118、110853。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯（北京化工厂）。
2 方法与结果
2.1 香附、丹参的薄层色谱鉴别
取本品内容物6 g，研细，加乙醚30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣用乙酸乙酯1 mL溶解作为供试品溶液。取丹参药材1 g，加乙醚5 mL，振摇，放置1 h，滤过，滤液挥干，残渣用乙酸乙酯1 mL溶解，作为丹参药材对照溶液[1]70。另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液[1]241。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取供试品溶液10 ?L、对照药材溶液5 ?L、对照品溶液2 ?L，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干[1]70，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与丹参对照药材和α-香附酮对照品色谱相应的位置上，显相同的暗斑斑点。
2.2 芍药苷的含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：230 nm。进样量为10 ?L。色谱柱的理论板塔数按芍药苷峰计算应不低于2 000。在此条件下，芍药苷与其他组分均能达到基线分离。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取芍药苷对照品10.6 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀，得到0.53 mg/mL对照品储备液（以95.7%计）。精密吸取对照品储备液1.2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到60.865 2 ?g/mL对照品溶液[1]97。
2.2.3 供试品溶液的制备 取颈椎康复丸适量，捣碎成中粉，精密称取粉末5 g，置100 mL量瓶中，精密加入45%甲醇至90 mL，摇匀，超声处理30 min（420 W，40 Hz），放冷，再加入45%甲醇定容至刻度，摇匀滤过，精密吸取续滤液2 mL，置50 mL容量瓶中，加45%甲醇至刻度，摇匀，用0.45 ?m针头式微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]97。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除白芍以外的其他药材，按工艺制成空白制剂，按“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 专属性考察 取颈椎康复丸对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，液相分析结果无干扰（见图1）。
2.2.6 线性关系考察 分别吸取已配好的0.53 mg/mL芍药苷对照品储备液0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。得到20.288 4、40.576 8、50.721 0、60.865 2、71.009 4、81.153 6、101.442 0 ?g/mL芍药苷对照品溶液。精密吸取各10 ?L，进样，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积对进样量做标准曲线，得芍药苷的回归方程为Y=653.1X+8.856，r2=0.999（n=7）。芍药苷在0.202 884～1.014 42 ?g范围内呈良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验 取颈椎康复丸样品（批号100528）供试液连续进样5次，每次10 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，结果RSD=0.176%（n=5），表明仪器精密度良好。 2.2.8 稳定性试验 将颈椎康复丸样品（批号100528）供试液每隔2 h进样10 ?L，连续4次，测得RSD=1.737%（n=4），表明8 h内样品供试液稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取颈椎康复丸样品（批号100528）制成5份供试品溶液，分别按上述色谱条件平行测定5次。结果RSD=1.538%（n=5），表明方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 取已知含量的颈椎康复丸样品粉末5份，每份精密称定0.5 g。照回收率试验方法操作，每份分别加入0.53 mg/mL芍药苷对照品溶液1.94 mL，同法测定，结果见表1。
3 讨论
薄层色谱鉴别丹参、香附时，在相同条件下石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）、苯-乙酸乙酯-冰醋酸（92∶5∶5）[2]和甲苯-乙酸乙酯（19∶1）[3-4]的展开效果表明，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂斑点清晰，阴性无干扰，可用于定性鉴别。
芍药苷是君药白芍中的标志性成分，因此，将其作为颈椎康复丸中含量测定指标。供试品溶液制备时，粉碎粒度应能通过80目筛，在此粒度下浸出效果好。在供试样品的提取中，分别考察了水和不同浓度甲醇为溶媒超声波提取芍药苷的浸出效果。结果表明，水和45%甲醇浸出量相近，但水提物的杂质较多，故采用45%甲醇为提取溶媒；超声提取2次和1次的效果无显著变化，故确定上述提取方法。流动相选择乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86），峰形良好，能够得到基线分离，重复性好，阴性无干扰，从而确定了芍药苷的液相色谱条件。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：70，97，241.
[2] 胡志芳，谢颖，胡律江，等.香附不同炮制方法的品质比较[J].江西中医学院学报，2010，22（6）：48-49.
[3] 段喜云.溶栓通脉胶囊中丹参的薄层色谱鉴别方法[J].中国中医药现代远程教育，2010，8（10）：193.
[4] 孙丽娟，郭东兰，李传兵.心痛宁滴丸中香附的薄层色谱鉴别及HPLC法测阿魏酸的含量[J].中国微生态学杂志，2009，21（7）：620-621.
（收稿日期：2012-03-09，编辑：陈静）
关键词：颈椎康复丸；芍药苷；高效液相色谱法；薄层色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）08-0059-02
颈椎康复丸为首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，是由白芍、丹参、香附等药物组成的水丸剂型，具有平肝柔筋、行气祛湿、补益肝肾之功效，临床用于肝气不舒、风寒湿痹所致肝肾不足之各种类型眩晕无力、手麻肩痛、酸胀活动受限等症状。为有效控制药品质量，保证临床用药的安全有效，笔者对其质量标准进行了研究，采用薄层色谱法（TLC）对丹参、香附进行定性鉴别研究，采用高效液相色谱法（HPLC）测定白芍的有效成分芍药苷的含量，为颈椎康复丸的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪Agilent1200，AL204型电子天平（METTLER TOLEDO），超声波清洗器（AS20500BDT），暗箱式紫外分析仪（ZF-20D），薄层色谱硅胶预制板SGF254板（烟台市化学工业研究所），点样器，展开容器，显色装置。
芍药苷对照品（批号110736-200934，含量95.7%），α-香附酮对照品（批号110748-200709，含量100%），丹参对照药材（批号120923-200912），均购自中国药品生物制品检定所。颈椎康复丸（首都医科大学附属北京中医医院委托北京勃然制药有限公司加工，批准文号：京药制字Z20053283），批号080722、081214、090830、091227、100528、100913、110118、110853。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯（北京化工厂）。
2 方法与结果
2.1 香附、丹参的薄层色谱鉴别
取本品内容物6 g，研细，加乙醚30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣用乙酸乙酯1 mL溶解作为供试品溶液。取丹参药材1 g，加乙醚5 mL，振摇，放置1 h，滤过，滤液挥干，残渣用乙酸乙酯1 mL溶解，作为丹参药材对照溶液[1]70。另取α-香附酮对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液[1]241。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取供试品溶液10 ?L、对照药材溶液5 ?L、对照品溶液2 ?L，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干[1]70，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与丹参对照药材和α-香附酮对照品色谱相应的位置上，显相同的暗斑斑点。
2.2 芍药苷的含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：230 nm。进样量为10 ?L。色谱柱的理论板塔数按芍药苷峰计算应不低于2 000。在此条件下，芍药苷与其他组分均能达到基线分离。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取芍药苷对照品10.6 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀，得到0.53 mg/mL对照品储备液（以95.7%计）。精密吸取对照品储备液1.2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到60.865 2 ?g/mL对照品溶液[1]97。
2.2.3 供试品溶液的制备 取颈椎康复丸适量，捣碎成中粉，精密称取粉末5 g，置100 mL量瓶中，精密加入45%甲醇至90 mL，摇匀，超声处理30 min（420 W，40 Hz），放冷，再加入45%甲醇定容至刻度，摇匀滤过，精密吸取续滤液2 mL，置50 mL容量瓶中，加45%甲醇至刻度，摇匀，用0.45 ?m针头式微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]97。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除白芍以外的其他药材，按工艺制成空白制剂，按“2.2.3”项下方法制备，即得。
2.2.5 专属性考察 取颈椎康复丸对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，液相分析结果无干扰（见图1）。
2.2.6 线性关系考察 分别吸取已配好的0.53 mg/mL芍药苷对照品储备液0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。得到20.288 4、40.576 8、50.721 0、60.865 2、71.009 4、81.153 6、101.442 0 ?g/mL芍药苷对照品溶液。精密吸取各10 ?L，进样，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积对进样量做标准曲线，得芍药苷的回归方程为Y=653.1X+8.856，r2=0.999（n=7）。芍药苷在0.202 884～1.014 42 ?g范围内呈良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验 取颈椎康复丸样品（批号100528）供试液连续进样5次，每次10 ?L，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，结果RSD=0.176%（n=5），表明仪器精密度良好。 2.2.8 稳定性试验 将颈椎康复丸样品（批号100528）供试液每隔2 h进样10 ?L，连续4次，测得RSD=1.737%（n=4），表明8 h内样品供试液稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取颈椎康复丸样品（批号100528）制成5份供试品溶液，分别按上述色谱条件平行测定5次。结果RSD=1.538%（n=5），表明方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率试验 取已知含量的颈椎康复丸样品粉末5份，每份精密称定0.5 g。照回收率试验方法操作，每份分别加入0.53 mg/mL芍药苷对照品溶液1.94 mL，同法测定，结果见表1。
3 讨论
薄层色谱鉴别丹参、香附时，在相同条件下石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）、苯-乙酸乙酯-冰醋酸（92∶5∶5）[2]和甲苯-乙酸乙酯（19∶1）[3-4]的展开效果表明，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂斑点清晰，阴性无干扰，可用于定性鉴别。
芍药苷是君药白芍中的标志性成分，因此，将其作为颈椎康复丸中含量测定指标。供试品溶液制备时，粉碎粒度应能通过80目筛，在此粒度下浸出效果好。在供试样品的提取中，分别考察了水和不同浓度甲醇为溶媒超声波提取芍药苷的浸出效果。结果表明，水和45%甲醇浸出量相近，但水提物的杂质较多，故采用45%甲醇为提取溶媒；超声提取2次和1次的效果无显著变化，故确定上述提取方法。流动相选择乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86），峰形良好，能够得到基线分离，重复性好，阴性无干扰，从而确定了芍药苷的液相色谱条件。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：70，97，241.
[2] 胡志芳，谢颖，胡律江，等.香附不同炮制方法的品质比较[J].江西中医学院学报，2010，22（6）：48-49.
[3] 段喜云.溶栓通脉胶囊中丹参的薄层色谱鉴别方法[J].中国中医药现代远程教育，2010，8（10）：193.
[4] 孙丽娟，郭东兰，李传兵.心痛宁滴丸中香附的薄层色谱鉴别及HPLC法测阿魏酸的含量[J].中国微生态学杂志，2009，21（7）：620-621.
（收稿日期：2012-03-09，编辑：陈静）