论文部分内容阅读
【摘要】目的 建立红曲保健食品中洛伐他汀的含量测定方法。方法 采用Hypersil C18（4.6×250mm，5μm），以甲醇-水-磷酸（75：25：0.2）为流动相，流速1.0mL/min，检测波长238nm，进样10μL。结果 线性：洛伐他汀在0.205～1.845μg浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；回收率：平均回收率为99.89%，RSD为1.05%。结论 本法简便、快速、准确，可作为红曲保健食品中洛伐他汀的质控方法。
【关键词】HPLC；恩替卡韦分散片；含量测定
红曲是以籼米为原料，采用现代生物工程技术分离出优质的红曲霉菌（monascuspurpureus）经液体深层发酵精制而成的一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。红曲内含有多种他汀类成分（最主在的存在形式为酸式和内酯式），辅助降血脂功效显著，因此而被广泛的应用于保健食品领域，目前，国内生产企业大多采用《保健食品功效成分及卫生检验规范》中的方法测定洛伐他汀含量，原理是将不同存在形式的洛伐他汀经预处理转化为内酯式，采用内酯式对照品定量，从而控制保健食品质量。然而，经我中心研究表明：该方法萃取程序受样品状态影响严重，并不能完全保证红曲中的洛伐他汀成分完全被检出而经常会造成检验结果偏低，影响实验人员正确的结果判定，本文采用碱化预处理方法，将不同存在形式的洛伐他汀转化为酸式结构，再经HPLC法测定含量，样品处理方法简便，结果准确可靠。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 Waters515型高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器。
1.1.2 试剂 甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为色谱纯，氢氧化钠为分析纯，洛伐他汀对照品（购自中国药品生物制品检定所），红曲保健食品制剂均为本厂自制。
2 试验方法与结果
2.1 色谱条件
Hypersil C18（4.6×250mm，5μm），以甲醇-水-磷酸（75：25：0.2）为流动相，流速1.0mL/min，检测波长238nm，进样10μL。理论塔板数按洛伐他汀峰计算应不低于3000，洛伐他汀峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
2.2 溶液的配制
2.2.1 标准储备液的制备 准确称取洛伐他汀标准品50mg，加入流动相并定容至100mL。此溶液每mL含0.5mg洛伐他汀。
2.2.2 标准使用液的制备 精密量取上述标准储备液1mL用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容至5mL，50℃条件下超声1.5小时，放置至室温后静置1小时。此溶液每mL含100μg洛伐他汀。
2.2.2 供试品溶液制备 取样品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于洛伐他汀50mg）于100 mL量瓶中，加入60mL75%乙醇摇匀，室温下超声50min，加入75%乙醇定容至刻度，冷却至室温后以3000r/min的旋转速度离心10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，精密吸取续滤液1mL置5mL量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容，50℃条件下超声1.5小时，放置至室温后静置1小时。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性试验
按处方配制不含红曲的空白片，依法测定，结果在洛伐他汀出峰处无吸收，故空白辅料不干扰含量测定。
2.3.2 线性关系
精密称取洛伐他汀对照品0.1025g，依法配制标准储备液、标准使用液，浓度为205μg/mL。精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，分别置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取10μL分别注入高效液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为模坐标进行线性回归，绘制标准曲线，结果表明，在0.205～1.845μg范围内呈线性关系，得回归方程：A=4.902×105C+5.882×104 r=0.9999。
2.3.3 精密度试验
取线性关系试验项下（浓度为102.5μg/mL）的对照品溶液，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6次RSD%为0.29%，方法精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
取含量测定线性关系试验项下（浓度为102.5μg/mL）的供试品溶液，分别于0、1、2、3小时精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果RSD值小于2%，表明含量测定溶液在3小时内测定稳定。
2.3.5 回收率试验
取相当于20片的主药量与辅料量，精密称定，混合均匀，研细，精密称取细粉适量（约相当于洛伐他汀40mg、50mg、60mg）各三份，分别置100 mL量瓶中，加入60mL75%乙醇摇匀，室温下超声50min，加入75%乙醇定容至刻度，冷却至室温后以3000r/min的旋转速度离心10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，精密吸取续滤液1mL置5mL量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容，50℃条件下超声1.5小时，放置至室温后静置1小时。取线性关系试验项下（浓度为102.5μg/mL）的供试品溶液，作为对照品溶液。精密量取上述溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果：平均回收率为99.88%，RSD为1.05%。本方法准确度良好。
3 讨论
红曲中洛伐他汀存在形式多样，其主要为酸式和内酯式结构，据文献报道：洛伐他汀含量测定方法有3种：第一种是分别测一内酯和开环形式，但有机溶剂提取后除了内酯与开环形式外，尚含有有机溶剂和洛伐他汀的酯化形式，检测结果不准确；第二种是酯化处理将酯式形式转化为内酯形式，测定其总量，而实际上很难转化完全；第三种是碱化处理将内酯式转化为酸式形式，测定其总量，因内酯式仅在纯甲醇中较为稳定，在水-醇溶剂中酸式形式更稳定。本文采用第三种方法对红曲保健食品进行含量测定，回收率接近100，方法科学、准确、可靠。并且，我中心通过对含量测定碱化条件的充分筛选，使样品预处理过程简便快捷。
参考文献
[1]张小茜，周富荣，石济民.高效液相色谱法测血脂康胶囊及红曲中洛伐他汀的含量.中国中药杂志，1997，22（4）：222～224.
[2]罗仁才，孙开奇，谢申猛，韩英.赵妍平红曲中洛伐他汀总量的测定方法.卫生研究，2003，32（2）：157～158.
【关键词】HPLC；恩替卡韦分散片；含量测定
红曲是以籼米为原料，采用现代生物工程技术分离出优质的红曲霉菌（monascuspurpureus）经液体深层发酵精制而成的一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。红曲内含有多种他汀类成分（最主在的存在形式为酸式和内酯式），辅助降血脂功效显著，因此而被广泛的应用于保健食品领域，目前，国内生产企业大多采用《保健食品功效成分及卫生检验规范》中的方法测定洛伐他汀含量，原理是将不同存在形式的洛伐他汀经预处理转化为内酯式，采用内酯式对照品定量，从而控制保健食品质量。然而，经我中心研究表明：该方法萃取程序受样品状态影响严重，并不能完全保证红曲中的洛伐他汀成分完全被检出而经常会造成检验结果偏低，影响实验人员正确的结果判定，本文采用碱化预处理方法，将不同存在形式的洛伐他汀转化为酸式结构，再经HPLC法测定含量，样品处理方法简便，结果准确可靠。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 Waters515型高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器。
1.1.2 试剂 甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为色谱纯，氢氧化钠为分析纯，洛伐他汀对照品（购自中国药品生物制品检定所），红曲保健食品制剂均为本厂自制。
2 试验方法与结果
2.1 色谱条件
Hypersil C18（4.6×250mm，5μm），以甲醇-水-磷酸（75：25：0.2）为流动相，流速1.0mL/min，检测波长238nm，进样10μL。理论塔板数按洛伐他汀峰计算应不低于3000，洛伐他汀峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
2.2 溶液的配制
2.2.1 标准储备液的制备 准确称取洛伐他汀标准品50mg，加入流动相并定容至100mL。此溶液每mL含0.5mg洛伐他汀。
2.2.2 标准使用液的制备 精密量取上述标准储备液1mL用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容至5mL，50℃条件下超声1.5小时，放置至室温后静置1小时。此溶液每mL含100μg洛伐他汀。
2.2.2 供试品溶液制备 取样品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于洛伐他汀50mg）于100 mL量瓶中，加入60mL75%乙醇摇匀，室温下超声50min，加入75%乙醇定容至刻度，冷却至室温后以3000r/min的旋转速度离心10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，精密吸取续滤液1mL置5mL量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容，50℃条件下超声1.5小时，放置至室温后静置1小时。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性试验
按处方配制不含红曲的空白片，依法测定，结果在洛伐他汀出峰处无吸收，故空白辅料不干扰含量测定。
2.3.2 线性关系
精密称取洛伐他汀对照品0.1025g，依法配制标准储备液、标准使用液，浓度为205μg/mL。精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，分别置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；精密量取10μL分别注入高效液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为模坐标进行线性回归，绘制标准曲线，结果表明，在0.205～1.845μg范围内呈线性关系，得回归方程：A=4.902×105C+5.882×104 r=0.9999。
2.3.3 精密度试验
取线性关系试验项下（浓度为102.5μg/mL）的对照品溶液，精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，连续进样6次RSD%为0.29%，方法精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
取含量测定线性关系试验项下（浓度为102.5μg/mL）的供试品溶液，分别于0、1、2、3小时精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果RSD值小于2%，表明含量测定溶液在3小时内测定稳定。
2.3.5 回收率试验
取相当于20片的主药量与辅料量，精密称定，混合均匀，研细，精密称取细粉适量（约相当于洛伐他汀40mg、50mg、60mg）各三份，分别置100 mL量瓶中，加入60mL75%乙醇摇匀，室温下超声50min，加入75%乙醇定容至刻度，冷却至室温后以3000r/min的旋转速度离心10min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，精密吸取续滤液1mL置5mL量瓶中，用0.2mol/L氢氧化钠溶液定容，50℃条件下超声1.5小时，放置至室温后静置1小时。取线性关系试验项下（浓度为102.5μg/mL）的供试品溶液，作为对照品溶液。精密量取上述溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果：平均回收率为99.88%，RSD为1.05%。本方法准确度良好。
3 讨论
红曲中洛伐他汀存在形式多样，其主要为酸式和内酯式结构，据文献报道：洛伐他汀含量测定方法有3种：第一种是分别测一内酯和开环形式，但有机溶剂提取后除了内酯与开环形式外，尚含有有机溶剂和洛伐他汀的酯化形式，检测结果不准确；第二种是酯化处理将酯式形式转化为内酯形式，测定其总量，而实际上很难转化完全；第三种是碱化处理将内酯式转化为酸式形式，测定其总量，因内酯式仅在纯甲醇中较为稳定，在水-醇溶剂中酸式形式更稳定。本文采用第三种方法对红曲保健食品进行含量测定，回收率接近100，方法科学、准确、可靠。并且，我中心通过对含量测定碱化条件的充分筛选，使样品预处理过程简便快捷。
参考文献
[1]张小茜，周富荣，石济民.高效液相色谱法测血脂康胶囊及红曲中洛伐他汀的含量.中国中药杂志，1997，22（4）：222～224.
[2]罗仁才，孙开奇，谢申猛，韩英.赵妍平红曲中洛伐他汀总量的测定方法.卫生研究，2003，32（2）：157～158.