【摘 要】
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目的探讨应用大肠杆菌Klenow大片段同时补平及切平DNA 3＇凹端或3＇凸端的可行性.方法以构建乙型肝水(乙肝)病毒S基因的真核表达载体为例,用KpnI及Xhol I消解含乙肝病毒前S/S基因
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目的探讨应用大肠杆菌Klenow大片段同时补平及切平DNA 3＇凹端或3＇凸端的可行性.方法以构建乙型肝水(乙肝)病毒S基因的真核表达载体为例,用KpnI及Xhol I消解含乙肝病毒前S/S基因的质粒,切除质粒中的前S区基因序列.通过K1enow大片段的核酸外切酶的活性切平质粒KpnI切口的3＇凸端,再利用其聚合酶活性补平XholI的3＇凹端.处理后的质粒经连接酶作用而自身环化后,转化并筛选阳性克隆.结果重组质粒获得了限制性内切酶分析的证实;对重组质粒的序列测定表明,KpnI及Xho1I酶切端经Klenow大片段切(补)平并重新连接后其接续口端序列与预期一致.结论对质粒作内部改建中,质粒两端分别为3＇凸端及3＇凹端时,可以同时利用口enow大片段的两种酶活性将DNA末端修饰为平端,以便于使质粒自身环化.
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