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【摘 要】本实验采用超滤技术去除羟基喜树碱中的细菌内毒素。超滤后有效成分透过率为96.2%。超滤后细菌内毒素的去除效果：细菌内毒素去除率为96.0%。实验结果表明此方法可用于羟基喜树碱中细菌内毒素的去除。
【关键词】超滤技术；羟基喜树碱；研究
羟基喜树碱是从我国特有的珙垌科乔木―喜树中分离提取的一种微量生物碱。羟基喜树碱抗癌机制独特，通过选择性的抑制拓扑异构酶I而干扰DNA的复制，具有高效低毒、广谱抗癌的特点，与其它常用抗肿瘤药物无交叉耐药性，对多种抗药性肿瘤仍然有效[1-2]。羟基喜树碱是目前从喜树中分离的20多个单体中抗癌作用最强的化合物。羟基喜树碱临床用于膀胱癌、直肠癌、肝癌、白血病及头颈部肿瘤等[3-9]。超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离，从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。超滤技术具有滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏；滤过程不发生相变化；能耗低；超滤技术分离效率高；流程短；操作简便；易于控制和维护等特点。本实验采用超滤技术去除羟基喜树碱中的细菌内毒素。
1.仪器与试药
P230高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）； ABS220-4分析天平（德祥科技有限公司）；板框超滤膜（海宁市桃沅膜分离厂，截留分子量MWCO=10kDa）；QTR3120基本加热型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）；BET-72细菌内毒素测定仪（天大天发科技有限公司）；LPD2500多管漩涡混合仪（莱普特科学仪器（北京）有限公司）；XYG-H帕恩特痕量分析级超纯水机（北京湘顺源科技有限公司）；10L大型旋转蒸发仪（北京赛美思仪器设备有限公司）；KHW-D-1LC精密拉伸水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）；SHB-III 循环水真空泵（西安中诺仪器有限公司）；BT100-01蠕动泵（保定齐力恒流泵有限公司）；TGL20MW台式大容量高速冷冻离心机（湖南赫西离心机仪器有限公司）；0.5平米板框式超滤器（吉林敖腾生物科技有限责任公司）；DGG-9030A电热鼓风干燥箱（北京鸿达天矩试验设备有限公司）。动态浊度法鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院）；细菌内毒素检查用水（石家庄启迪科技有限公司）；细菌内毒素指示剂（北京欣惠泽奥科技有限公司）。
2.含量测定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[10-12]。色谱柱为依利特hypersil BDSC18色谱柱（4.6*250*5u）；甲醇-水（85：15）为流动相；检测波长为266nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备
取羟基喜树碱适量，精密称取，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声提取20分钟，放置至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3对照品溶液的制备
精密称取羟基喜树碱对照品约10mg，置100mL容量瓶中，用流动相超声波振荡溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3.实验方法
3.1供试样品溶液的制备
称取羟基喜树碱1克，用100毫升注射用水溶解，加人细菌内毒素适量，混匀，作为原液，标识备用。取上述配制好的药液原液以10 kDa分子量超滤膜进行试验。分别取药液原液和超滤液检测其中细菌内毒素的含量。
3.2细菌内毒素的检测
3.2.1标准曲线的制作
分别配内毒素浓度为2.0、0.5、0.125、0.03125EU/mL的标准溶液，各取0.1毫升分别加到预先加有0.1毫升鲎试剂溶液的反应管内，混合均匀，进行检测并同时作阴性对照2管。以反应时间t的对数为纵坐标，细菌内毒素浓度C为横坐标，按最小二乘法进行统计分析，得标准曲线。
3.2.2干扰实验及内毒素定量测定
分别将各样品药液用细菌内毒素检查用水稀释，以此稀释液作为供试液，同时分别将此倍数稀释液配制成含内毒素标准品0.5EU/mL的溶液，作为阳性对照。分别取上述溶液0.1毫升加到预先加有0.1毫升鲎试剂反应管内，混匀，进行检测。
4.结果与讨论
细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，但大量内毒素进入血液就会引起发热反应。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、疫苗类、透析液等制剂必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。细菌内毒素具有耐热性和化学稳定性，不易被去除，目前注射剂生产常用活性炭吸附法去除热原，但去除效率并不能保证。本实验采用超滤技术去除羟基喜树碱中的细菌内毒素。超滤后有效成分的变化：原液（超滤前）高效液相测定含量为98.62EU/ml，总量为1克，有效成分量为98.61克，超滤后高效液相测定含量为99.09EU/ml，总量为0.98克，有效成分量为94.83克，透过率为96.2%。超滤后细菌内毒素的去除效果：原液细菌内毒素浓度为7.5216EU/ml，超滤后细菌内毒素浓度为0.3003EU/ml，细菌内毒素去除率为96.0%。超滤技术可以很好的去除羟基喜树碱原料药溶解液中细菌内毒素，有效成分损失极其微少，可提高其用药安全性。
【参考文献】
[1]吴永芳，袁云，毛松柏.羟基喜树碱并用丹参治疗消化系癌的疗效观察[J].癌症，1990（03）.
[2]黄慧强，姜文奇，胡晓桦，林旭滨，刘魁凤，李宇红，林忠，申维玺，陈强，何友兼，管忠震；羟基喜树碱冻干粉针（拓僖）单药治疗晚期恶性肿瘤临床研究的初步报告[J].癌症，2003（12）.
[3]周军，樊亦军，陈定南，梁灼，杨婉玲.喜树碱（CPT）与10—羟基喜树碱（HCPT）的抗肿瘤活性与毒性比较[J].癌症，1991（03）.
[4]李立源，张冬艳，白凤武.喜树碱及其衍生物的研究进展[J].大连民族学院学报，2001（02）.
[5]董生，肖湘生，陈庆华，陆伟根，刚宪祯.羟基喜树碱明胶微球肝动脉化疗栓塞治疗肝肿瘤的实验研究[J].实用放射学杂志，1998（02）.
[6]沈靖南.肿瘤药敏预测试验与临床化疗效应相关性的研究概况[J].癌症，1994（06）.
[7]张力，李苏，廖海，姜文奇，管忠震.羟基喜树碱Ⅰ期药代动力学及人体耐受性临床研究[J].癌症，2001（12）.
[8]李苏，姜文奇，张力，廖海，管忠震.羟基喜树碱（HCPT）不同给药方式的药理学比较[J].中国临床药理学杂志，2001（06）.
[9]董生，肖湘生，郝楠馨.羟基喜树碱明胶微球肝动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌[J].中国医学计算机成像杂志，1999（01）.
[10]彭茗，陆丹，刘瑾，杨永健.HPLC同时测定羟喜树碱注射液的有关物质及含量[J].中国现代应用药学，2011（09）.
[11]路伟，张志荣，刘滨.高效液相色谱法测定兔血浆中羟基喜树碱的含量[J].广东药学，1999（04）.
[12]娄志红，孙煌，姜连阁，白政忠.HPLC法测定羟喜树碱注射液中有关物质[J].药物分析杂志，2009（03）.
【关键词】超滤技术；羟基喜树碱；研究
羟基喜树碱是从我国特有的珙垌科乔木―喜树中分离提取的一种微量生物碱。羟基喜树碱抗癌机制独特，通过选择性的抑制拓扑异构酶I而干扰DNA的复制，具有高效低毒、广谱抗癌的特点，与其它常用抗肿瘤药物无交叉耐药性，对多种抗药性肿瘤仍然有效[1-2]。羟基喜树碱是目前从喜树中分离的20多个单体中抗癌作用最强的化合物。羟基喜树碱临床用于膀胱癌、直肠癌、肝癌、白血病及头颈部肿瘤等[3-9]。超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离，从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。超滤技术具有滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏；滤过程不发生相变化；能耗低；超滤技术分离效率高；流程短；操作简便；易于控制和维护等特点。本实验采用超滤技术去除羟基喜树碱中的细菌内毒素。
1.仪器与试药
P230高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）； ABS220-4分析天平（德祥科技有限公司）；板框超滤膜（海宁市桃沅膜分离厂，截留分子量MWCO=10kDa）；QTR3120基本加热型超声波清洗器（天津市瑞普电子仪器公司）；BET-72细菌内毒素测定仪（天大天发科技有限公司）；LPD2500多管漩涡混合仪（莱普特科学仪器（北京）有限公司）；XYG-H帕恩特痕量分析级超纯水机（北京湘顺源科技有限公司）；10L大型旋转蒸发仪（北京赛美思仪器设备有限公司）；KHW-D-1LC精密拉伸水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）；SHB-III 循环水真空泵（西安中诺仪器有限公司）；BT100-01蠕动泵（保定齐力恒流泵有限公司）；TGL20MW台式大容量高速冷冻离心机（湖南赫西离心机仪器有限公司）；0.5平米板框式超滤器（吉林敖腾生物科技有限责任公司）；DGG-9030A电热鼓风干燥箱（北京鸿达天矩试验设备有限公司）。动态浊度法鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院）；细菌内毒素检查用水（石家庄启迪科技有限公司）；细菌内毒素指示剂（北京欣惠泽奥科技有限公司）。
2.含量测定
2.1色谱条件
依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[10-12]。色谱柱为依利特hypersil BDSC18色谱柱（4.6*250*5u）；甲醇-水（85：15）为流动相；检测波长为266nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。
2.2供试品溶液的制备
取羟基喜树碱适量，精密称取，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声提取20分钟，放置至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3对照品溶液的制备
精密称取羟基喜树碱对照品约10mg，置100mL容量瓶中，用流动相超声波振荡溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3.实验方法
3.1供试样品溶液的制备
称取羟基喜树碱1克，用100毫升注射用水溶解，加人细菌内毒素适量，混匀，作为原液，标识备用。取上述配制好的药液原液以10 kDa分子量超滤膜进行试验。分别取药液原液和超滤液检测其中细菌内毒素的含量。
3.2细菌内毒素的检测
3.2.1标准曲线的制作
分别配内毒素浓度为2.0、0.5、0.125、0.03125EU/mL的标准溶液，各取0.1毫升分别加到预先加有0.1毫升鲎试剂溶液的反应管内，混合均匀，进行检测并同时作阴性对照2管。以反应时间t的对数为纵坐标，细菌内毒素浓度C为横坐标，按最小二乘法进行统计分析，得标准曲线。
3.2.2干扰实验及内毒素定量测定
分别将各样品药液用细菌内毒素检查用水稀释，以此稀释液作为供试液，同时分别将此倍数稀释液配制成含内毒素标准品0.5EU/mL的溶液，作为阳性对照。分别取上述溶液0.1毫升加到预先加有0.1毫升鲎试剂反应管内，混匀，进行检测。
4.结果与讨论
细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，但大量内毒素进入血液就会引起发热反应。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、疫苗类、透析液等制剂必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。细菌内毒素具有耐热性和化学稳定性，不易被去除，目前注射剂生产常用活性炭吸附法去除热原，但去除效率并不能保证。本实验采用超滤技术去除羟基喜树碱中的细菌内毒素。超滤后有效成分的变化：原液（超滤前）高效液相测定含量为98.62EU/ml，总量为1克，有效成分量为98.61克，超滤后高效液相测定含量为99.09EU/ml，总量为0.98克，有效成分量为94.83克，透过率为96.2%。超滤后细菌内毒素的去除效果：原液细菌内毒素浓度为7.5216EU/ml，超滤后细菌内毒素浓度为0.3003EU/ml，细菌内毒素去除率为96.0%。超滤技术可以很好的去除羟基喜树碱原料药溶解液中细菌内毒素，有效成分损失极其微少，可提高其用药安全性。
【参考文献】
[1]吴永芳，袁云，毛松柏.羟基喜树碱并用丹参治疗消化系癌的疗效观察[J].癌症，1990（03）.
[2]黄慧强，姜文奇，胡晓桦，林旭滨，刘魁凤，李宇红，林忠，申维玺，陈强，何友兼，管忠震；羟基喜树碱冻干粉针（拓僖）单药治疗晚期恶性肿瘤临床研究的初步报告[J].癌症，2003（12）.
[3]周军，樊亦军，陈定南，梁灼，杨婉玲.喜树碱（CPT）与10—羟基喜树碱（HCPT）的抗肿瘤活性与毒性比较[J].癌症，1991（03）.
[4]李立源，张冬艳，白凤武.喜树碱及其衍生物的研究进展[J].大连民族学院学报，2001（02）.
[5]董生，肖湘生，陈庆华，陆伟根，刚宪祯.羟基喜树碱明胶微球肝动脉化疗栓塞治疗肝肿瘤的实验研究[J].实用放射学杂志，1998（02）.
[6]沈靖南.肿瘤药敏预测试验与临床化疗效应相关性的研究概况[J].癌症，1994（06）.
[7]张力，李苏，廖海，姜文奇，管忠震.羟基喜树碱Ⅰ期药代动力学及人体耐受性临床研究[J].癌症，2001（12）.
[8]李苏，姜文奇，张力，廖海，管忠震.羟基喜树碱（HCPT）不同给药方式的药理学比较[J].中国临床药理学杂志，2001（06）.
[9]董生，肖湘生，郝楠馨.羟基喜树碱明胶微球肝动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌[J].中国医学计算机成像杂志，1999（01）.
[10]彭茗，陆丹，刘瑾，杨永健.HPLC同时测定羟喜树碱注射液的有关物质及含量[J].中国现代应用药学，2011（09）.
[11]路伟，张志荣，刘滨.高效液相色谱法测定兔血浆中羟基喜树碱的含量[J].广东药学，1999（04）.
[12]娄志红，孙煌，姜连阁，白政忠.HPLC法测定羟喜树碱注射液中有关物质[J].药物分析杂志，2009（03）.