论文部分内容阅读
摘要：液质联用是目前灵敏度和分辨度最高的定量分析技术，对于微量样品中极低有机物含量的测定，譬如血药浓度的准确定量，液质联用几乎是唯一的选择。然而，液相色谱在液质联用中所起到的作用仅仅是排除对待测物质的电离干扰，亦即把待测物与可能产生电离干扰的基底物质分离。如果样品中不存在電离干扰物，以质谱本身104至106的高分辨度，大不必与液相色谱联用，采用流动注射（FIA）方式进样直接用质谱进行定量分析显然更为简单快速。而且，用针筒缓缓进样，无需流动相，既省溶剂又能进一步提高灵敏度，完成一个样品分析一般只需10秒左右。本文介分析用样品原液做连续流动注射进行质谱定量的耗材并介绍和比较了用质谱峰面积及峰高定量的方法。
关键词：连续流动注射、质谱定量分析、质谱快速定量、质谱峰积分。
概述：精准检测是实现很多精准技术的前提，譬如当今的精准医疗和个性化用药，首先就必须对血药浓度进行准确定量。目前化学分析中最佳的精准检测技术就是液质联用（LC/MS），原因在于质谱是化学分析中灵敏度和分辨度最高而适用性最广的仪器，液相色谱（LC）在LC/MS中主要用来将样品中影响待测物电离的干扰物质与待测物本身分离，只要不干扰待测物电离，质谱104至106的高分辨度加之定量分析采用单一离子对监测（MRM）或多离子对监测（SRM）的工作模式，使得样品中任何共生物质对待测物的定量测定几乎毫无干扰。如果样品中不存在干扰电离的物质，或者样品处理过程中预先排除了电离干扰物，那么质谱定量就大不必与LC联用。除去LC对于质谱定量有很多好处，既可以大大简化仪器系统，方便操作，避免LC LC就日常发生的堵塞、柱效变坏、溶剂告罄等等问题，又消除了大量溶剂进入质谱离子源而引起其中电场不断变化的问题，因而能提高系统的稳定性。
所以，排除了样品中电离干扰物后，样品就不必经过LC分离而以流动注射（FIA）方式直接引入质谱离子源进行定量分析，而最佳的FIA方式是用针筒缓慢将样品原液连续推送进质谱。这中连续FIA方式（CFIA）可以极大提高喷雾效率并减少样品稀释，分析灵敏度由此可以提高数倍至数百倍。CFIA需要的样品量可以少到1ul以内，分析时间10秒左右就够了，速度轻而易举可在LC/MS基础上增加10倍以上，而且这种方法不仅省掉LC节省下1/3的仪器费用，而且不用流动相，既节省溶剂也减少废液。
电离干扰物质的消除
采用CFIA进行质谱定量的前提是样品中不存在干扰电离的物质，对于常压离子源（API），干扰电离的物质主要有三种：强离子性化合物如强酸强碱、高稠度物质如较大分子量的表面活性剂、多电荷物质如蛋白、磷酸盐等。强离子性化合物由于其导电性能好使得离子源的高电压无法维系，从而无法提供物质电离所需的能量；稠度高的物质使得进入离子源的液体难以雾化，因而降低离子化效率；可以带多电荷的物质由于能吸收多个电荷且保持相对稳定，使得喷雾产生的雾珠难以发生常压化学离子化过程所需的电荷转移或电喷雾离子化过程中的多次临界爆炸，因而妨碍待测物的离子化。这三类电离干扰物有一个共同特点：极性很大，水溶性较好。充分利用这一特点有可能消除样品中的电离干扰物。
广东联捷研发出来的一种血样处理填料就是一个很好的实例，用这种新型填料制作的萃取柱可以紧紧吸附血样中的脂类糖类和各种蛋白等物质，而血液中存在的小分子药物不被填料吸附，血样加到萃取柱后用合适的缓冲液洗脱，得到的萃取液基本上不存在影响电离的物质，而小分子药物基本上完全从柱子上洗脱下来，得到接近100%的回收率。因此，由此得到的萃取液最适合用CFIA质谱定量分析。
流动注射的样品浓度优势
CFIA直接用样品原液进样，相比液质联用，直接进样时进入质谱仪的待测物数量提高很多。例如，进样10ul到流量为1ml/min的LC/MS系统，假如得到的色谱峰底线宽度为0.4分钟（24秒）、每秒采集一个数据点，峰点样品量大约是总量的15%，此时的样品稀释比例大约为3/5倍，亦即，峰点样品浓度大约为原样品浓度的0.09，降了10多倍，因此用原样做CFIA，浓度比LC/MS高10倍，即便不考虑低流速时喷雾效率高的因素，仅因浓度，CFIA的灵敏度就应该比LC/MS的高10倍。
流动注射的喷雾效率优势
以针筒连续进样的CFIA法常常可以得到极高的灵敏度，比起LC/MS一般高出100倍以上，除了上述样品原液浓度高10倍左右，另外的10倍则来自高电压喷雾的雾化效率，因为样品原液通常用纯溶剂如甲醇或乙腈配制，粘度低，喷雾效果好，而进样速度往往不高于10ul/min，一般用5ul/min以下，这样的流量在5KV左右的高电压下喷雾非常充分，而且不需要任何辅助气体。API离子源的离子化效率与喷雾效率成正比，因此，CFIA以至于超微量喷雾（nanospray）是提高质谱分析灵敏度的良好途径。
连续进样的定量分析方法
通常LC/MS的定量是用峰面积对浓度作图做出分析曲线，然后测定样品中待测物的峰面积，再通过分析曲线确定样品浓度。CFIA的信号不是色谱峰，理想情况是一段直线，对直线进行积分显然与对色谱峰积分是等效的。但是一般LC/MS软件没有现成的线段积分功能。用手工积分則因为基线高低和起终点选择差异而难以做到客观可靠。在此我们提供一种取平均质谱图然后对质谱峰进行积分的定量方法，具体做法是：①对连续流动注射线段取平均质谱；②把平均质谱的数字信号加和起来；③用加和的质谱信号对浓度作图便得到分析曲线。
这个方法和手工积分一样简便，原理也一样，但是由于在积分过程中取了平均，单个点对最后结果影响较小，而且参与平均的点值越多，其影响也就越小。这个方法对于选择离子（SIM）、单对离子（MRM）及多对离子（SRM）模式的质谱定量非常适用。而且，由于质谱峰的宽度基本是固定的，用峰高对浓度作图得到的结果与用质谱峰面积对浓度作图几乎完全一致（见图二）。 圖一显示了一组利血平针筒连续对ThermoFisher LTQ进样得到的平均SRM质谱图谱，标准利血平溶液浓度是1、10、20、40、70、100 ppm。表一是列出了各个浓度对应的的质谱峰积分面积。即便是1ppb的低浓度，响应值都接近104。
结论
采用合适的样品处理方式除去电离干扰物，然后将样品原液以低流速连续进样（CFIA）是实现快速而高灵敏质谱定量分析的最佳途径。将这一策略应用到个性化用药的精准检测上，将有可能解决这个领域仪器复杂操作麻煩收费昂贵等一系列问题，为全面推广个性化用药乃至推动精准医疗、精准制药都有可能起到至关重要的作用。
参考文献：
Xu， Weihong； Sandford， Richard； Worsfold， Paul； Carlton， Alexandra； Hanrahan， Grady （2005）. “Flow Injection Techniques in Aquatic Environmental Analysis： Recent Applications and Technological Advances”. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 35 （3）： 237. doi：10.1080/10408340500323362.
Tyson， Julian F. （1985）. “Flow injection analysis techniques for atomic-absorption spectrometry. a review”. The Analyst. 110 （5）： 419–569. Bibcode：1985Ana...110..419T. PMID 4025835. doi：10.1039/an9851000419.
Anastos， N.； Barnett， NW； Hindson， BJ； Lenehan， CE； Lewis， SW （2004）. “Comparison of soluble manganese（IV） and acidic potassium permanganate chemiluminescence detection using flow injection and sequential injection analysis for the determination of ascorbic acid in Vitamin C tablets”. Talanta. 64 （1）： 130–4. PMID 18969577. doi：10.1016/j.talanta.2004.01.021.
Ruscika， Jarda. “Flow Injection Tutorial”. www.flowinjectiontutorial.com. Retrieved 2016-03-28.
Ruzicka， Jarda. “Flow Injection Analysis”. Retrieved 25 August 2013.
Trojanowicz， M. （2000）. Flow injection analysis ： instrumentation and applications. World Scientific.
关键词：连续流动注射、质谱定量分析、质谱快速定量、质谱峰积分。
概述：精准检测是实现很多精准技术的前提，譬如当今的精准医疗和个性化用药，首先就必须对血药浓度进行准确定量。目前化学分析中最佳的精准检测技术就是液质联用（LC/MS），原因在于质谱是化学分析中灵敏度和分辨度最高而适用性最广的仪器，液相色谱（LC）在LC/MS中主要用来将样品中影响待测物电离的干扰物质与待测物本身分离，只要不干扰待测物电离，质谱104至106的高分辨度加之定量分析采用单一离子对监测（MRM）或多离子对监测（SRM）的工作模式，使得样品中任何共生物质对待测物的定量测定几乎毫无干扰。如果样品中不存在干扰电离的物质，或者样品处理过程中预先排除了电离干扰物，那么质谱定量就大不必与LC联用。除去LC对于质谱定量有很多好处，既可以大大简化仪器系统，方便操作，避免LC LC就日常发生的堵塞、柱效变坏、溶剂告罄等等问题，又消除了大量溶剂进入质谱离子源而引起其中电场不断变化的问题，因而能提高系统的稳定性。
所以，排除了样品中电离干扰物后，样品就不必经过LC分离而以流动注射（FIA）方式直接引入质谱离子源进行定量分析，而最佳的FIA方式是用针筒缓慢将样品原液连续推送进质谱。这中连续FIA方式（CFIA）可以极大提高喷雾效率并减少样品稀释，分析灵敏度由此可以提高数倍至数百倍。CFIA需要的样品量可以少到1ul以内，分析时间10秒左右就够了，速度轻而易举可在LC/MS基础上增加10倍以上，而且这种方法不仅省掉LC节省下1/3的仪器费用，而且不用流动相，既节省溶剂也减少废液。
电离干扰物质的消除
采用CFIA进行质谱定量的前提是样品中不存在干扰电离的物质，对于常压离子源（API），干扰电离的物质主要有三种：强离子性化合物如强酸强碱、高稠度物质如较大分子量的表面活性剂、多电荷物质如蛋白、磷酸盐等。强离子性化合物由于其导电性能好使得离子源的高电压无法维系，从而无法提供物质电离所需的能量；稠度高的物质使得进入离子源的液体难以雾化，因而降低离子化效率；可以带多电荷的物质由于能吸收多个电荷且保持相对稳定，使得喷雾产生的雾珠难以发生常压化学离子化过程所需的电荷转移或电喷雾离子化过程中的多次临界爆炸，因而妨碍待测物的离子化。这三类电离干扰物有一个共同特点：极性很大，水溶性较好。充分利用这一特点有可能消除样品中的电离干扰物。
广东联捷研发出来的一种血样处理填料就是一个很好的实例，用这种新型填料制作的萃取柱可以紧紧吸附血样中的脂类糖类和各种蛋白等物质，而血液中存在的小分子药物不被填料吸附，血样加到萃取柱后用合适的缓冲液洗脱，得到的萃取液基本上不存在影响电离的物质，而小分子药物基本上完全从柱子上洗脱下来，得到接近100%的回收率。因此，由此得到的萃取液最适合用CFIA质谱定量分析。
流动注射的样品浓度优势
CFIA直接用样品原液进样，相比液质联用，直接进样时进入质谱仪的待测物数量提高很多。例如，进样10ul到流量为1ml/min的LC/MS系统，假如得到的色谱峰底线宽度为0.4分钟（24秒）、每秒采集一个数据点，峰点样品量大约是总量的15%，此时的样品稀释比例大约为3/5倍，亦即，峰点样品浓度大约为原样品浓度的0.09，降了10多倍，因此用原样做CFIA，浓度比LC/MS高10倍，即便不考虑低流速时喷雾效率高的因素，仅因浓度，CFIA的灵敏度就应该比LC/MS的高10倍。
流动注射的喷雾效率优势
以针筒连续进样的CFIA法常常可以得到极高的灵敏度，比起LC/MS一般高出100倍以上，除了上述样品原液浓度高10倍左右，另外的10倍则来自高电压喷雾的雾化效率，因为样品原液通常用纯溶剂如甲醇或乙腈配制，粘度低，喷雾效果好，而进样速度往往不高于10ul/min，一般用5ul/min以下，这样的流量在5KV左右的高电压下喷雾非常充分，而且不需要任何辅助气体。API离子源的离子化效率与喷雾效率成正比，因此，CFIA以至于超微量喷雾（nanospray）是提高质谱分析灵敏度的良好途径。
连续进样的定量分析方法
通常LC/MS的定量是用峰面积对浓度作图做出分析曲线，然后测定样品中待测物的峰面积，再通过分析曲线确定样品浓度。CFIA的信号不是色谱峰，理想情况是一段直线，对直线进行积分显然与对色谱峰积分是等效的。但是一般LC/MS软件没有现成的线段积分功能。用手工积分則因为基线高低和起终点选择差异而难以做到客观可靠。在此我们提供一种取平均质谱图然后对质谱峰进行积分的定量方法，具体做法是：①对连续流动注射线段取平均质谱；②把平均质谱的数字信号加和起来；③用加和的质谱信号对浓度作图便得到分析曲线。
这个方法和手工积分一样简便，原理也一样，但是由于在积分过程中取了平均，单个点对最后结果影响较小，而且参与平均的点值越多，其影响也就越小。这个方法对于选择离子（SIM）、单对离子（MRM）及多对离子（SRM）模式的质谱定量非常适用。而且，由于质谱峰的宽度基本是固定的，用峰高对浓度作图得到的结果与用质谱峰面积对浓度作图几乎完全一致（见图二）。 圖一显示了一组利血平针筒连续对ThermoFisher LTQ进样得到的平均SRM质谱图谱，标准利血平溶液浓度是1、10、20、40、70、100 ppm。表一是列出了各个浓度对应的的质谱峰积分面积。即便是1ppb的低浓度，响应值都接近104。
结论
采用合适的样品处理方式除去电离干扰物，然后将样品原液以低流速连续进样（CFIA）是实现快速而高灵敏质谱定量分析的最佳途径。将这一策略应用到个性化用药的精准检测上，将有可能解决这个领域仪器复杂操作麻煩收费昂贵等一系列问题，为全面推广个性化用药乃至推动精准医疗、精准制药都有可能起到至关重要的作用。
参考文献：
Xu， Weihong； Sandford， Richard； Worsfold， Paul； Carlton， Alexandra； Hanrahan， Grady （2005）. “Flow Injection Techniques in Aquatic Environmental Analysis： Recent Applications and Technological Advances”. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 35 （3）： 237. doi：10.1080/10408340500323362.
Tyson， Julian F. （1985）. “Flow injection analysis techniques for atomic-absorption spectrometry. a review”. The Analyst. 110 （5）： 419–569. Bibcode：1985Ana...110..419T. PMID 4025835. doi：10.1039/an9851000419.
Anastos， N.； Barnett， NW； Hindson， BJ； Lenehan， CE； Lewis， SW （2004）. “Comparison of soluble manganese（IV） and acidic potassium permanganate chemiluminescence detection using flow injection and sequential injection analysis for the determination of ascorbic acid in Vitamin C tablets”. Talanta. 64 （1）： 130–4. PMID 18969577. doi：10.1016/j.talanta.2004.01.021.
Ruscika， Jarda. “Flow Injection Tutorial”. www.flowinjectiontutorial.com. Retrieved 2016-03-28.
Ruzicka， Jarda. “Flow Injection Analysis”. Retrieved 25 August 2013.
Trojanowicz， M. （2000）. Flow injection analysis ： instrumentation and applications. World Scientific.