【摘 要】
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【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及X-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核
【机 构】
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天津科技大学生物工程学院; 天津国际生物医药联合研究院; 河北师范大学生命科学学院; 中国医学科学院放射医学研究所天津市分子核医学重点实验室;
【基金项目】
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Supported by the National Natural Science Foundation of China(31300601);the PUMC Youth Fund(33320140186);the Natural Science Foundation of Hebei Province(C2015205212);the Research Funding of Hebei N
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【目的】假坚强芽孢杆菌四氢嘧啶羟化酶蛋白纯化、晶体制备及X-射线衍射研究。【方法】通过PCR从假坚强芽孢杆菌OF4中克隆获得四氢嘧啶羟化酶基因,构建原核表达载体,经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和分子排阻色谱法纯化蛋白,289 K下采用座滴法进行晶体筛选和制备,在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku Micro Max-007 HF)收集晶体衍射数据。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了适合晶体生长的蛋白Bp EctD。通过筛选最终在蛋白浓度为6.5 mg/mL及含有0.2 mol/L Mg Cl2·6H2O,0.1 mol/L Bis-Tris p H6.5,25%(W/V)聚乙二醇3,350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体,其大小约为360μm×240μm×60μm,并在100K下成功收集了衍射数据,晶体衍射分辨率为2.40,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=45.18,b=58.87,c=68.81,α=77.48°,β=86.03°,γ=66.97°,每个不对称单位中含有2个Bp EctD单体,马修斯系数为2.443/Da,溶剂含量约为49.53%。【结论】衍射数据的成功收集为假坚强芽孢杆菌OF4四氢嘧啶羟化酶三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明四氢嘧啶羟化酶的催化机制。
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