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【摘 要】目的：建立从大鼠骨髓分离、培养间充质干细胞的标化流程，并探讨BMMSCs生物学特性。方法：无菌条件下剪取2～3周龄SD大鼠两侧完整股骨，采用D-PBS冲洗骨髓腔，含骨髓细胞的洗脱液经离心后收集细胞沉淀，用含10%FBS的LG-DMEM，于37?C、5% CO2、饱和湿度环境下进行BMMSCs原代培养，每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞；当BMMSCs生长汇合度达60%～70%时，按2～5×105/ml细胞密度进行传代培养。采用流式细胞术对第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子检查。结果：分离纯化的BMMSCs具有典型MSCs特征，高表达CD90和CD29，不表达CD45；结论：表明普通贴壁法成功分离培养了具有间充质干细胞表型特征的大鼠BMMSCs
【关键词】间充质干细胞；大鼠
【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02
引言
研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。因此，本实验采用最简单普通贴壁培养法分离、培养大鼠BMMSCs，若能得到较为纯净BMMSCs，在节约了培养BMMSCs成本基础上，提供了一种既简单又能稳定获得纯净BMMSCs的方法，为相关的实验提供丰富的BMMSCs。
1 材料和方法
时间及地点：于2009-09/2011-02在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。材料：清洁级SD大鼠，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心[许可证号：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的动物实验操作程序经遵义医学院实验动物伦理委员会审议批准。主要试剂：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）
实验方法：
大鼠BMMSCs的分离、培养：颈椎脱臼法处死2～3周龄SD大鼠，无菌条件下手术取下两侧完整股骨（连同肌肉），浸入0.1%新吉尔灭15 min；剥离股骨附着肌肉，并用含双抗的D-PBS反复清洗。剪开股骨两端，用D-PBS冲洗骨髓腔，收集含骨髓细胞的洗脱液，1000 g离心5 min，弃上清，细胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培养基重悬浮，每只大鼠分离的骨髓细胞接种两个T25培养瓶，置37 °C、5% CO2饱和湿度培养箱培养。每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞，倒置相差显微镜下每日观察细胞生长情况并照相。当BMMSCs生长汇合度达60～70 %时，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105个/ml细胞密度进行传代培养。
大鼠BMMSCs表型鉴定：取第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子的流式细胞仪检测，具体步骤如下：0.125%胰酶消化BMMSCs并制成单细胞悬液，1000 g离心5 min；弃上清，加入D-PBS振荡混匀，1000 g离心5 min；弃上清，加入适量D-PBS振荡混匀；向预先加入各表型分子抗体的流式检测管内加入100 ?l细胞悬液（细胞数不少于100 000个），各管分别含PE Mouse IgG1/FITC Armenian Hamster IgG、PE anti-rat CD45/FITC anti-mouse/rat CD29及PE anti-rat CD90/mouse CD90.1不同荧光素标记的流式细胞仪检测抗体，振荡混匀，避光孵育20 min；每管加入2 ml D-PBS，振荡混匀，1000 g 离心5 min；弃上清，每管加入250 ?l 1%多聚甲醛固定液，振荡混匀，4 ?C保存待此后上机检测。
主要观察指标：BMMSCs生长情况及表型鉴定结果设计、实施、评估者：实验设计、评估为第二、六作者，实验实施为第一、二、三、四、六作者为主，均经过相关专业训练。
统计学处理：实验数据以均值±标准差（±s）表示，采用t检验，用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。P<0.05表示差异有显著性意义。
【关键词】间充质干细胞；大鼠
【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02
引言
研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。因此，本实验采用最简单普通贴壁培养法分离、培养大鼠BMMSCs，若能得到较为纯净BMMSCs，在节约了培养BMMSCs成本基础上，提供了一种既简单又能稳定获得纯净BMMSCs的方法，为相关的实验提供丰富的BMMSCs。
1 材料和方法
时间及地点：于2009-09/2011-02在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。材料：清洁级SD大鼠，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心[许可证号：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的动物实验操作程序经遵义医学院实验动物伦理委员会审议批准。主要试剂：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）
实验方法：
大鼠BMMSCs的分离、培养：颈椎脱臼法处死2～3周龄SD大鼠，无菌条件下手术取下两侧完整股骨（连同肌肉），浸入0.1%新吉尔灭15 min；剥离股骨附着肌肉，并用含双抗的D-PBS反复清洗。剪开股骨两端，用D-PBS冲洗骨髓腔，收集含骨髓细胞的洗脱液，1000 g离心5 min，弃上清，细胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培养基重悬浮，每只大鼠分离的骨髓细胞接种两个T25培养瓶，置37 °C、5% CO2饱和湿度培养箱培养。每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞，倒置相差显微镜下每日观察细胞生长情况并照相。当BMMSCs生长汇合度达60～70 %时，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105个/ml细胞密度进行传代培养。
大鼠BMMSCs表型鉴定：取第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子的流式细胞仪检测，具体步骤如下：0.125%胰酶消化BMMSCs并制成单细胞悬液，1000 g离心5 min；弃上清，加入D-PBS振荡混匀，1000 g离心5 min；弃上清，加入适量D-PBS振荡混匀；向预先加入各表型分子抗体的流式检测管内加入100 ?l细胞悬液（细胞数不少于100 000个），各管分别含PE Mouse IgG1/FITC Armenian Hamster IgG、PE anti-rat CD45/FITC anti-mouse/rat CD29及PE anti-rat CD90/mouse CD90.1不同荧光素标记的流式细胞仪检测抗体，振荡混匀，避光孵育20 min；每管加入2 ml D-PBS，振荡混匀，1000 g 离心5 min；弃上清，每管加入250 ?l 1%多聚甲醛固定液，振荡混匀，4 ?C保存待此后上机检测。
主要观察指标：BMMSCs生长情况及表型鉴定结果设计、实施、评估者：实验设计、评估为第二、六作者，实验实施为第一、二、三、四、六作者为主，均经过相关专业训练。
统计学处理：实验数据以均值±标准差（±s）表示，采用t检验，用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。P<0.05表示差异有显著性意义。