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论文摘要：文章分析了红芪多糖的分离纯化及初步的结构。
主题词： 红芪多糖 结构鉴定
中图分类号：G272.3
红芪（Radix Hedysari），为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz的干燥根，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表， 利尿托毒， 排脓， 敛疮生肌。红芪中含有氨基酸、有机酸、β-谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物活性物质。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用。特别是我们近几年的研究发现，经 70%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显。由于多糖为大分子化合物，分离纯化比较困难，而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之一，为了提高多糖的得率、纯度及活性，本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究，结合TLC、GC、IR等方法对 HPS-2 的结构进行了初步的分析，以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础。
1 材料与仪器
红芪，购自甘肃武都；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250（西安周鼎国生物技术有限责任公司）；单糖对照品（中国药品生物制品检定所）；Sephadex G-25（上海长征制药厂）；硅胶 G（青岛海洋化工厂）；其它试剂均为分析纯。
CR22G Ⅱ型离心机（日本日立）；UV-1700 型紫外仪（日本岛津）；GC-Clarus 500型气相色谱仪（美国 PerkinElmer公司）；红外光谱仪（Nicolet NEXUS 670）；BS-100A 自动部分收集器、HL-2 恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；美国Waters600型高效液相色谱仪，配 Waters2414型示差折光检测器。
2 方法
2.1 红芪多糖的提取纯化路线其流程如下。
2.1.1 提取红芪药材→粉碎→超声脱脂→热水提取3次→合并提取液→减压浓缩后离心→取上清液→乙醇沉淀→有机溶剂洗剂→透析→减压浓缩→冷冻干燥得粗多糖 HPS。
2.1.2 纯化粗多糖液→脱蛋白、色素→Sephadex G-25柱层析→洗脱液透析→浓缩→冷冻干燥→精制红芪多糖 HPS-2。
2.2 蛋白质和多糖含量的测定蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法，多糖含量采用苯酚-硫酸法。
2.3 脱蛋白方法
称取一定量的粗多糖，加入适量蒸馏水，60℃加热溶解，备用。本实验采用 3种脱蛋白的方法。
2.3.1 Sevag法取粗多糖溶液，加入等体积的氯仿-正丁醇（V/V为 4∶1）试剂，混合振摇 30 min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。
2.3.2 三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液体积 0.1倍量的三氯乙酸，低温（4℃）剧烈振摇 30 min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。
2.3.3 三氯乙酸-正丁醇法
取粗多糖溶液，加入等体积的三氯乙酸-正丁醇（V/V为 1∶10）试剂，振荡 10 min，静置分层，收集下层水溶液，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。
2.4 红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖，溶解于适量蒸馏水中。过氧化氢除色素，减压浓缩，经醇沉、离心、冷冻干燥得红芪多糖1（HPS-1），取适量的 HPS-1，蒸馏水溶解后，Sephadex G-25柱分离，蒸馏水洗脱，流速 0.8 ml/min，每 3 ml收集1份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并主峰流出液，减压浓缩至一定体积，冷冻干燥得 HPS-2。
2.5 纯度鉴定用 HPLC法，TSK-gel G2500PW色谱柱，示差折光检测器，流动相为双蒸水，流速 1.0 ml/min，检测器温度35℃，样品浓度4 mg/ml，进样量50 μl。同时取该样品溶液在 200～400 nm范围内进行紫外扫描。
2.6 气相色谱参照文献，多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物，以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行 GC分析。色谱条件： OV-101毛细管柱（50 m×0. 32 mm），载气为N2 ，流速 5 ml/min，分流比 40∶1，FID氢火焰检测器，汽化室温度 250℃，检测器温度 280℃。程序升温：110℃（保持 5 min）→（5℃/min）→ 280 ℃（保持 20 min）。进样量 0.4 μl。
2.7 薄层色谱[6]取 15mg HPS-2，三氟醋酸彻底水解，水解产物溶于 1 ml蒸馏水中，以标准单糖为对照，分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样，上行二次展开，展开剂： 醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2（V/V）；自然风干后显色，显色剂： 苯胺-邻苯二甲酸溶液，烘箱中 105 ℃加热 5～10 min显色。
2.8 红外光谱测定 取 2 mg HPS-3，KBr压片，测定红外光谱。
3 结果
3.1 脱蛋白方法的选择以蛋白脱除率和多糖损失率为指标，比较 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白效果。Sevag法的多糖损失率最低，但脱蛋白率也最低；三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白率最高，多糖损失率最低；三氯乙酸法的脱蛋白率达 30%以上，但多糖损失最高。综合各方面的因素，本实验选取三氯乙酸-正丁醇法脱除红芪多糖中的蛋白质。
3.2 紅芪多糖分离纯化红芪多糖经Sephadex G-25柱层析纯化分离的洗脱曲线。仅出现 1个洗脱峰， 收集主峰， 透析， 浓缩，冷冻干燥， 得到 HPS-2。
3.3 纯度鉴定HPS-2的紫外扫描在 260～280nm处吸收峰消失，茚三酮反应呈阴性，说明样品中的蛋白质基本除尽，也无核酸存在；碘-碘化钾反应呈阴性，表明样品为非淀粉多糖；经 HPLC凝胶色谱后为单一对称峰。表明其为均一组分；苯酚-硫酸法测定 HPS-2的糖含量为 98.06%。
3.4 红芪多糖的结构分析
3.4.1 气相色谱分析
气相色谱分析。比较标准品和样品的保留时间，可见多糖 HPS- 2由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成。其摩尔组成比例为 0.3∶0.2∶2.7∶16.1∶2.0。
3.4.2 薄层色谱分析HPS-2 经薄层色谱。检出半乳糖（Rf对=Rf样=0.40）、葡萄糖（Rf对=Rf样=0.30）、阿拉伯糖（Rf对=0.20，Rf样=0.19）、木糖（Rf对=Rf样=0.62）和鼠李糖（Rf对=Rf样=0.77），其中木糖和鼠李糖含量较低，斑点不明显。这与气相色谱结果一致。
3.4.3 红外分析从IR谱图，HPS-2在 3 600～3 200 cm-1、3 000～2 800 cm-1和 1 400～1 200 cm-1处均具有多糖的特征吸收峰。1 154、1 080、1 024 cm-1处为 β-吡喃糖基的振动峰；898 cm-1为 β-糖苷键的吸收峰，820 cm-1处为 α-吡喃糖的吸收峰，说明多糖 HPS-2中存在 α和 β两种类型的苷键，并以吡喃型糖为主。
4 结论
本实验比较了3种脱蛋白方法，三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白效果最好，脱除率达 37.2%，多糖损失率少。利用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25柱层析分离纯化红芪多糖得 HPS-2，经 HPLC及紫外扫描为均一多糖，不含蛋白质和核酸。
GC、TLC及 IR分析 HPS-2的糖基组成和结构为，主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为 0.3∶0.2∶2.7∶16.1∶2.0，单糖主要为吡喃糖，异头碳以 β型为主，并有少量的 α型。这为红芪多糖的深入研究打下了理论基础，特别为其组成的快速分析提供了可靠的方法。
参考文献：
1、惠和平，封士兰，赵良功，石义凯，刘小花，红芪多糖的纯化及初步结构鉴定，论文网，2011.06
主题词： 红芪多糖 结构鉴定
中图分类号：G272.3
红芪（Radix Hedysari），为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz的干燥根，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表， 利尿托毒， 排脓， 敛疮生肌。红芪中含有氨基酸、有机酸、β-谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物活性物质。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用。特别是我们近几年的研究发现，经 70%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显。由于多糖为大分子化合物，分离纯化比较困难，而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之一，为了提高多糖的得率、纯度及活性，本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究，结合TLC、GC、IR等方法对 HPS-2 的结构进行了初步的分析，以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础。
1 材料与仪器
红芪，购自甘肃武都；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250（西安周鼎国生物技术有限责任公司）；单糖对照品（中国药品生物制品检定所）；Sephadex G-25（上海长征制药厂）；硅胶 G（青岛海洋化工厂）；其它试剂均为分析纯。
CR22G Ⅱ型离心机（日本日立）；UV-1700 型紫外仪（日本岛津）；GC-Clarus 500型气相色谱仪（美国 PerkinElmer公司）；红外光谱仪（Nicolet NEXUS 670）；BS-100A 自动部分收集器、HL-2 恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；美国Waters600型高效液相色谱仪，配 Waters2414型示差折光检测器。
2 方法
2.1 红芪多糖的提取纯化路线其流程如下。
2.1.1 提取红芪药材→粉碎→超声脱脂→热水提取3次→合并提取液→减压浓缩后离心→取上清液→乙醇沉淀→有机溶剂洗剂→透析→减压浓缩→冷冻干燥得粗多糖 HPS。
2.1.2 纯化粗多糖液→脱蛋白、色素→Sephadex G-25柱层析→洗脱液透析→浓缩→冷冻干燥→精制红芪多糖 HPS-2。
2.2 蛋白质和多糖含量的测定蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法，多糖含量采用苯酚-硫酸法。
2.3 脱蛋白方法
称取一定量的粗多糖，加入适量蒸馏水，60℃加热溶解，备用。本实验采用 3种脱蛋白的方法。
2.3.1 Sevag法取粗多糖溶液，加入等体积的氯仿-正丁醇（V/V为 4∶1）试剂，混合振摇 30 min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。
2.3.2 三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液体积 0.1倍量的三氯乙酸，低温（4℃）剧烈振摇 30 min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。
2.3.3 三氯乙酸-正丁醇法
取粗多糖溶液，加入等体积的三氯乙酸-正丁醇（V/V为 1∶10）试剂，振荡 10 min，静置分层，收集下层水溶液，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。
2.4 红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖，溶解于适量蒸馏水中。过氧化氢除色素，减压浓缩，经醇沉、离心、冷冻干燥得红芪多糖1（HPS-1），取适量的 HPS-1，蒸馏水溶解后，Sephadex G-25柱分离，蒸馏水洗脱，流速 0.8 ml/min，每 3 ml收集1份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并主峰流出液，减压浓缩至一定体积，冷冻干燥得 HPS-2。
2.5 纯度鉴定用 HPLC法，TSK-gel G2500PW色谱柱，示差折光检测器，流动相为双蒸水，流速 1.0 ml/min，检测器温度35℃，样品浓度4 mg/ml，进样量50 μl。同时取该样品溶液在 200～400 nm范围内进行紫外扫描。
2.6 气相色谱参照文献，多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物，以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行 GC分析。色谱条件： OV-101毛细管柱（50 m×0. 32 mm），载气为N2 ，流速 5 ml/min，分流比 40∶1，FID氢火焰检测器，汽化室温度 250℃，检测器温度 280℃。程序升温：110℃（保持 5 min）→（5℃/min）→ 280 ℃（保持 20 min）。进样量 0.4 μl。
2.7 薄层色谱[6]取 15mg HPS-2，三氟醋酸彻底水解，水解产物溶于 1 ml蒸馏水中，以标准单糖为对照，分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样，上行二次展开，展开剂： 醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2（V/V）；自然风干后显色，显色剂： 苯胺-邻苯二甲酸溶液，烘箱中 105 ℃加热 5～10 min显色。
2.8 红外光谱测定 取 2 mg HPS-3，KBr压片，测定红外光谱。
3 结果
3.1 脱蛋白方法的选择以蛋白脱除率和多糖损失率为指标，比较 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白效果。Sevag法的多糖损失率最低，但脱蛋白率也最低；三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白率最高，多糖损失率最低；三氯乙酸法的脱蛋白率达 30%以上，但多糖损失最高。综合各方面的因素，本实验选取三氯乙酸-正丁醇法脱除红芪多糖中的蛋白质。
3.2 紅芪多糖分离纯化红芪多糖经Sephadex G-25柱层析纯化分离的洗脱曲线。仅出现 1个洗脱峰， 收集主峰， 透析， 浓缩，冷冻干燥， 得到 HPS-2。
3.3 纯度鉴定HPS-2的紫外扫描在 260～280nm处吸收峰消失，茚三酮反应呈阴性，说明样品中的蛋白质基本除尽，也无核酸存在；碘-碘化钾反应呈阴性，表明样品为非淀粉多糖；经 HPLC凝胶色谱后为单一对称峰。表明其为均一组分；苯酚-硫酸法测定 HPS-2的糖含量为 98.06%。
3.4 红芪多糖的结构分析
3.4.1 气相色谱分析
气相色谱分析。比较标准品和样品的保留时间，可见多糖 HPS- 2由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成。其摩尔组成比例为 0.3∶0.2∶2.7∶16.1∶2.0。
3.4.2 薄层色谱分析HPS-2 经薄层色谱。检出半乳糖（Rf对=Rf样=0.40）、葡萄糖（Rf对=Rf样=0.30）、阿拉伯糖（Rf对=0.20，Rf样=0.19）、木糖（Rf对=Rf样=0.62）和鼠李糖（Rf对=Rf样=0.77），其中木糖和鼠李糖含量较低，斑点不明显。这与气相色谱结果一致。
3.4.3 红外分析从IR谱图，HPS-2在 3 600～3 200 cm-1、3 000～2 800 cm-1和 1 400～1 200 cm-1处均具有多糖的特征吸收峰。1 154、1 080、1 024 cm-1处为 β-吡喃糖基的振动峰；898 cm-1为 β-糖苷键的吸收峰，820 cm-1处为 α-吡喃糖的吸收峰，说明多糖 HPS-2中存在 α和 β两种类型的苷键，并以吡喃型糖为主。
4 结论
本实验比较了3种脱蛋白方法，三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白效果最好，脱除率达 37.2%，多糖损失率少。利用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25柱层析分离纯化红芪多糖得 HPS-2，经 HPLC及紫外扫描为均一多糖，不含蛋白质和核酸。
GC、TLC及 IR分析 HPS-2的糖基组成和结构为，主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为 0.3∶0.2∶2.7∶16.1∶2.0，单糖主要为吡喃糖，异头碳以 β型为主，并有少量的 α型。这为红芪多糖的深入研究打下了理论基础，特别为其组成的快速分析提供了可靠的方法。
参考文献：
1、惠和平，封士兰，赵良功，石义凯，刘小花，红芪多糖的纯化及初步结构鉴定，论文网，2011.06