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【摘 要】 目的缺血预处理对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤的研究 方法：采用wistar 大鼠原位肝移植模型，对照组供肝冷保存50min，试验组供肝分别冷保存时间50min，100min，150min，无肝期平均20min。128只大鼠随机分成4组；对照组，IP50组，供肝冷保存50min，IP100组，供肝冷保存100min，IP150组，供肝冷保存150min 每组的一半（n=8）用于观察生存率，另一半（n=8）用于移植再灌注2h后取血及肝脏检测。 结果 IP5组和IP100组大鼠一周存活率，血清NO水平分别为88%（7/8）和88%（7/8），（33.0±6.0） μmol/l，and （32.0±7.0） μmol/l，均高于对照组的50%血清ALT和TNF含量分别为（287 ±97）IU/L，and（337±83）IU/L，（1.15±0.23）ng/ml，and （1.17±0.19）ng/ml，均明显低于对照组（574±51）IU/L，and（1.61±0.27）ng/ml （p<0.05）， 组织病理改变也轻于对照组。IP150组的一周存活率，血清NO，TNF及ALT含量等分别与对照组相近 。
【关键词】 缺血预处理 肝移植 再灌注损伤
本实验通过大鼠原位肝移植模型，旨在研究IP是否对移植肝脏的缺血再灌注损伤具有保护作用，及IP对肝脏缺血再灌注的维持时间。
一、材料与方法
1.1 实验动物与材料
雄性健康wistar大鼠，体重280～300g，供体重量略轻于受体（<10g），供体禁食12h但不禁水，受体饮食不限，均购自哈尔滨医科大学动物实验中心。一氧化氮（硝酸还原酶法）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（TNF）试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.2 方法
大鼠原位肝移植模型制备 方法参照Kamada等二袖套法，即应用袖套法吻合肝下下腔静脉，以内置支撑管吻合胆管，不吻合肝动脉。将切除的供肝置于4℃生理盐水保存液中。袖套管由聚乙烯制成，受体手术也用乙醚半开放麻醉，切除受体肝脏后，供肝置入原位，用8-0线对端吻合肝上下腔静脉，供肝门静脉套管插入受体门静脉，结扎固定，支撑管插入受体肝下腔静脉和胆总管，结扎固定。
1.3 实验设计
取128只健康wistar大鼠，将大鼠随机分配到对照组，IP30组和IP100组和IP150组。每组10对。各组受体的一半（n=8）用于观察存活期，另一半（n=8）用于取材。各组供肝取出后分别置入4℃生理盐水中保存50min，50min，100min，150min.受体无肝期平均20±3 min。实验组获取供肝前阻断肝门血供10min，再灌注10min，然后以4℃肝素生理盐水灌洗供体肝脏。
1.4 指标检测
①各组大鼠1周存活率。②血样检测：各组大鼠于肝脏再灌注2h后经下腔静脉抽血， 全自动生分析仪测ALT、AST及LDH；血样离心（4℃，4000r/min，10min），取部分上清用部分上清置于-70℃冰箱保存，用相应的试剂盒测定TNF及NO； ③组织检测；保存于10%甲醛的金属沉淀液中用于HE染色，光镜检查。
采用SPSS软件，均数间的两两比较用q检验，存活率的比较用对数秩和检验（log-ranktest）。
二、结果
2.1 受体1周存活率
受体的 1 周存活率 ：B 组与 C 组的 1 周存活率均为 88 % （7/ 8） ，高于 A 组 50 % （4/ 8） （ P <0.05） ，差异有显著意义。D 组 37.5 %（3/ 8） 与 A 组之间的差异没有显著意义。
2.2 肝功能变化
移植肝脏再灌注2h后IP50，IP100两组AST、ALT及LDH，明显低于对照组和IP150组（P<0.001），提示IP50，IP100组移植肝脏所受到的损害较轻，且功能恢复更快更好，IP能为移植的肝脏提供保护，对照组与 IP150组之间差异无显著意义
2.3 各组血清TNF及NO含量变化
B，C组的血清 TNF水平于肝脏植入再灌注后2小时较 A 组的降低（ P <0.01） ；而血清 NO 水平较 A 组的升高 ，差异均有显著意义（ P < 0.05） 。D组血清 TNF及 NO 与 A 组的相比差异均无显著意义.
2.4 HE 染色光学显微镜检查 ：
发现 A 组和 D 组肝脏中央静脉周围的肝细胞浊肿、空泡变性明显 ，肝血窦变窄 ，而B 组和 C组肝脏的小叶结构基本正常 ，肝细胞也未见明显变化 ，说明 IP能够减轻移植肝脏的再灌注损伤。并能维持到保存后100min，于150min后保护作用基本消失。
3 讨论
IP 能够改善肝移植大鼠的存活率 ，IP 组大鼠血清的 ALT、及 LDH 水平较对照组明显降低 ，说明肝脏的功能也得到改善。IP 组血清中TNF 水平较对照组显著降低 ，说明 IP 能够降低 TNF的血清水平 ，从而减轻由 TNF 所介导的对移植肝脏的损伤。HE染色的病理组织学切片也证实 IP 能够使肝细胞受到的损伤显著减轻。并且IP的保护作用能维持100min，在经历150min较长时间缺血后IP保护作用基本消失。
NO 的作用是多方面的 ，对于缺血再灌注损伤 ，其所具有的保护作用主要表现在：清除过氧化阴离子而保护细胞免受氧化反应引起的细胞毒作用 ，调节血管张力、保护内皮细胞和肝细胞、改善微循环 ，阻止 TNF诱导的内皮细胞凋亡的发生等。本实验证实 IP 50组和 IP100min组的血清 NO 含量均高于对照组和IP100组，病理学切片显示肝血窦的形态基本正常。
综上所述，IP能够通过降低血清中TNF水平、增强移植肝脏的抗氧化能力等减轻缺血再灌注损伤，改善移植肝脏的功能和受体的存活率， 维持到肝脏再灌注后100分钟，并于150分钟保护作用基本消失。通过对IP的研究，对于临床进行门腔非转流状况下的背驮式肝移植后移植物的功能改善和存活、活体部分肝移植时获得质量更好的供肝以及如何在灌注不良的情况下改善供肝质量及保存时间等都具有非常重要的意义。
【关键词】 缺血预处理 肝移植 再灌注损伤
本实验通过大鼠原位肝移植模型，旨在研究IP是否对移植肝脏的缺血再灌注损伤具有保护作用，及IP对肝脏缺血再灌注的维持时间。
一、材料与方法
1.1 实验动物与材料
雄性健康wistar大鼠，体重280～300g，供体重量略轻于受体（<10g），供体禁食12h但不禁水，受体饮食不限，均购自哈尔滨医科大学动物实验中心。一氧化氮（硝酸还原酶法）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（TNF）试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.2 方法
大鼠原位肝移植模型制备 方法参照Kamada等二袖套法，即应用袖套法吻合肝下下腔静脉，以内置支撑管吻合胆管，不吻合肝动脉。将切除的供肝置于4℃生理盐水保存液中。袖套管由聚乙烯制成，受体手术也用乙醚半开放麻醉，切除受体肝脏后，供肝置入原位，用8-0线对端吻合肝上下腔静脉，供肝门静脉套管插入受体门静脉，结扎固定，支撑管插入受体肝下腔静脉和胆总管，结扎固定。
1.3 实验设计
取128只健康wistar大鼠，将大鼠随机分配到对照组，IP30组和IP100组和IP150组。每组10对。各组受体的一半（n=8）用于观察存活期，另一半（n=8）用于取材。各组供肝取出后分别置入4℃生理盐水中保存50min，50min，100min，150min.受体无肝期平均20±3 min。实验组获取供肝前阻断肝门血供10min，再灌注10min，然后以4℃肝素生理盐水灌洗供体肝脏。
1.4 指标检测
①各组大鼠1周存活率。②血样检测：各组大鼠于肝脏再灌注2h后经下腔静脉抽血， 全自动生分析仪测ALT、AST及LDH；血样离心（4℃，4000r/min，10min），取部分上清用部分上清置于-70℃冰箱保存，用相应的试剂盒测定TNF及NO； ③组织检测；保存于10%甲醛的金属沉淀液中用于HE染色，光镜检查。
采用SPSS软件，均数间的两两比较用q检验，存活率的比较用对数秩和检验（log-ranktest）。
二、结果
2.1 受体1周存活率
受体的 1 周存活率 ：B 组与 C 组的 1 周存活率均为 88 % （7/ 8） ，高于 A 组 50 % （4/ 8） （ P <0.05） ，差异有显著意义。D 组 37.5 %（3/ 8） 与 A 组之间的差异没有显著意义。
2.2 肝功能变化
移植肝脏再灌注2h后IP50，IP100两组AST、ALT及LDH，明显低于对照组和IP150组（P<0.001），提示IP50，IP100组移植肝脏所受到的损害较轻，且功能恢复更快更好，IP能为移植的肝脏提供保护，对照组与 IP150组之间差异无显著意义
2.3 各组血清TNF及NO含量变化
B，C组的血清 TNF水平于肝脏植入再灌注后2小时较 A 组的降低（ P <0.01） ；而血清 NO 水平较 A 组的升高 ，差异均有显著意义（ P < 0.05） 。D组血清 TNF及 NO 与 A 组的相比差异均无显著意义.
2.4 HE 染色光学显微镜检查 ：
发现 A 组和 D 组肝脏中央静脉周围的肝细胞浊肿、空泡变性明显 ，肝血窦变窄 ，而B 组和 C组肝脏的小叶结构基本正常 ，肝细胞也未见明显变化 ，说明 IP能够减轻移植肝脏的再灌注损伤。并能维持到保存后100min，于150min后保护作用基本消失。
3 讨论
IP 能够改善肝移植大鼠的存活率 ，IP 组大鼠血清的 ALT、及 LDH 水平较对照组明显降低 ，说明肝脏的功能也得到改善。IP 组血清中TNF 水平较对照组显著降低 ，说明 IP 能够降低 TNF的血清水平 ，从而减轻由 TNF 所介导的对移植肝脏的损伤。HE染色的病理组织学切片也证实 IP 能够使肝细胞受到的损伤显著减轻。并且IP的保护作用能维持100min，在经历150min较长时间缺血后IP保护作用基本消失。
NO 的作用是多方面的 ，对于缺血再灌注损伤 ，其所具有的保护作用主要表现在：清除过氧化阴离子而保护细胞免受氧化反应引起的细胞毒作用 ，调节血管张力、保护内皮细胞和肝细胞、改善微循环 ，阻止 TNF诱导的内皮细胞凋亡的发生等。本实验证实 IP 50组和 IP100min组的血清 NO 含量均高于对照组和IP100组，病理学切片显示肝血窦的形态基本正常。
综上所述，IP能够通过降低血清中TNF水平、增强移植肝脏的抗氧化能力等减轻缺血再灌注损伤，改善移植肝脏的功能和受体的存活率， 维持到肝脏再灌注后100分钟，并于150分钟保护作用基本消失。通过对IP的研究，对于临床进行门腔非转流状况下的背驮式肝移植后移植物的功能改善和存活、活体部分肝移植时获得质量更好的供肝以及如何在灌注不良的情况下改善供肝质量及保存时间等都具有非常重要的意义。