【摘 要】
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背景: 骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子,被认为是最具有前途的骨诱导物质.目的: 构建入骨形成蛋
【机 构】
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贵州省人民医院骨科,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科
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背景: 骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子,被认为是最具有前途的骨诱导物质.目的: 构建入骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况.设计、时间及地点: 自身对照实验,于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成.材料;pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠;成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供.方法: 从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T-hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体,将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后,用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞,反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达.主要观察指标: ①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果.②重组质粒pGEM-T-hBMP-2.和PcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定.③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达.结果: 人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后,获得1.2 kb条带.经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因,重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2.结论: 实验成功克隆入骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体.
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