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摘要：目的 优化黄连有效成分的HPLC条件，建立肝豆灵片中黄连相关成分的定性定量分析方法。方法 采用HPLC对肝豆灵片中黄连的有效成分进行定性定量分析。流动相为乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0），流速为1.0 mL/min，检测波长为345 nm。结果 可以鉴别出黄连中表小檗碱、黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀4个成分，且阴性对照无干扰；盐酸小檗碱对照品进样量在0.058～0.580 μg、盐酸巴马汀对照品进样量在0.030～0.300 μg范围内与吸收度峰面积值呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.18%、99.99%，RSD分别为2.40%、1.70%。结论 本研究建立的方法操作简便、准确、重复性好，可用于肝豆灵片的质量控制。
关键词：肝豆灵片；黄连有效成分；高效液相色谱法；定性分析；定量分析
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0087-03
Qualitative and Quantitative Analysis of Active Components of Copditis Rhizoma in Gandouling Pills by HPLC
CHEN Li， WANG Sheng， QIN Xiu-juan， MENG Mei
The First Affiliated Hospital of Anhui College of TCM， State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China
Abstract： Objective To optimize the HPLC conditions for active components of Coptidis Rhizoma； To establish qualitative and quantitative analysis method for related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. Methods HPLC was used for the qualitative and quantitative analysis of related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. With acetonitrile： 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution = 50：50 （per 100 mL was added 0.4 g sodium dodecyl sulfate， and then adjusted pH to 4.0 with phosphoric acid） as mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 345 nm. Results Four components of Coptidis Rhizoma can be identified， including berberine， coptisine， berberine hydrochloride and palmatine chloride， and the negative control had no disturbance. Berberine hydrochloride reference and the absorbance peak area value showed a good linear relationship within 0.058–0.580 μg sample volume， and palmatine chloride reference was the same within 0.030–0.300 μg sample volume. The average recovery was 98.18% and 99.99%， and RSD was 2.40% and 1.70%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and with good repeatability， which can be applied effectively to the quality control of Gandouling Pills.
Keywords： Gandouling Pills； active components of Coptidis Rhizoma； HPLC； qualitative analysis； quantitative analysis
作為国家重大疑难病防治中心和国家中医药管理局肝豆状核变性协作组组长单位，安徽中医药大学第一附属医院脑病中心专家根据长期临床实践，认为痰瘀互结贯穿于该病始终，提出以化痰祛瘀为治法，总结出具有祛痰化瘀、软坚散结功效的医院制剂肝豆灵片（皖药制字Z20050071），该制剂在临床使用20余年，在改善肝豆状核变性患者神经功能方面取得良好疗效。为保证该制剂临床使用的安全性和疗效的稳定性，本研究建立方中臣药黄连主要有效成分的HPLC测定方法，以有效控制本品质量。
1 仪器与试药 Agilent1260高效液相色谱仪（DAD紫外检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置和自动进样器），Analytical C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），超声波清洗器（SK3200H，天津天有利科技有限公司），电子天平（Sartorius BP211D）。
肝豆灵片（批号20170609、20170310、20161024、20160703、20160318、20151123），安徽省中医院制剂室；小檗碱对照品（批号110713-201212），中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，屈臣蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液
精密称取盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品适量，加甲醇制成每毫升含盐酸小檗碱0.029 mg、盐酸巴马汀0.060 mg的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液
取本品粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1∶100）50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用盐酸-甲醇（1∶100）补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液
取缺黄连的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.2 色谱条件与系统适用性试验
采用Analytical C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0），检测波长345 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min。吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪测定。理论塔板数按小檗碱峰计算n=12 442，分离度R=3.18，拖尾因子T=0.99，均符合药典规定。
2.3 黄连相关成分定性分析
分别吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定，结果供试品色谱中依次出现4个含量较高的色谱峰（保留时间分别为14.119、1.639、18.767、20.888 min）。色谱图见图1。以小檗碱为参照，4个色谱峰的相对保留时间（见表1）与2015年版《中华人民共和国药典》黄连项下含量测定项中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱保留时间规定值[1]的误差均小于5%，符合要求。因此，可以初步验证供试品色谱呈现的4个色谱峰分别为黄连相关成分表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱。1、2号峰保留时间分别与盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品溶液一致，且阴性对照无干扰，从而进一步验证1、2、3、4号峰分别为小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱。
2.4 盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量测定
2.4.1 标准曲线的绘制
分别精密吸取0.029 mg/mL盐酸小檗碱对照品溶液2、4、6、8、16、20 μL，0.006 mg/mL盐酸巴马汀对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μL，依次注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，分别以盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的进样量为横坐标，相应的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的线性回归方程分别为：Y=4139.522 4X+2.032 2，r=0.999 98；Y=4844.996 8X+7.030 8，r=0.999 96。结果盐酸小檗碱对照品进样量在0.058～0.580 μg、盐酸巴马汀对照品进样量在0.030～0.300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4.2 精密度试验
精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积积分值，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为0.33%、1.10%，表明本法精密度良好。
2.4.3 稳定性试验
取供试品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、10 h进样测定，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为0.23%、1.14%，表明供试品溶液中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀在10 h内稳定。
2.4.4 重复性试验
取样品（批号20140307）6份，按含量测定项下方法制备并测定，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为2.36%、1.48%，表明本法重复性良好。
2.4.5 样品的测定与含量限度的确定
取样品，每批平行3份，分别按含量测定项下方法测定盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量，结果见表2。
2.4.6 加样回收率试验
精密称取已知盐酸小檗碱含量的样品（10.15 mg/g）适量，分别精密加入盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品适量，按含量测定项下方法制备供试品溶液并测定，结果见表3、表4。
3 讨论
本研究建立了肝豆灵片中黄连相关成分HPLC定性定量分析方法，对制剂中黄连的4个成分表小檗碱、黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀进行了定性分析，并对盐酸小檗碱、盐酸巴马汀进行了含量测定。
基于原国家食品药品监督管理局《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》规定以检测方中君臣药、贵重药和毒剧药為主的原则，试验初期设计将方中君药姜黄的主要活性成分姜黄素作为含量测定项质控指标[2]，并对其HPLC含量测定条件进行摸索，结果供试品在与姜黄素对照品色谱峰相应的保留时间无对应峰出现，表明该成分在制剂中含量较低，故未采用姜黄素作为定量指标，而选用含量较高的臣药黄连主要活性成分盐酸小檗碱、盐酸巴马汀作为含量测定指标[3]。制剂中君药主要有效成分含量较低的原因及对整体药效是否有影响，还需进一步探究。
HPLC测定盐酸小檗碱的流动相体系较多。本试验考察了3种流动相体系的色谱分离情况[1，4-7]：①乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）；②乙腈-三乙胺-冰醋酸-水；③乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL中加十二烷基磺酸钠0.1 g）。结果供试品溶液以①为流动相，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与其他成分均能很好地分离，供试品色谱图中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀保留时间与对照品一致，且阴性对照无干扰。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：304.
[2] 崔语涵，安潇，王海峰，等.姜黄化学成分研究[J].中草药，2016，47（7）：1074-1078.
[3] 杜庆波.黄连化学成分及药理活性研究概况[J].包头医学院学报， 2015，31（5）：153-156.
[4] 王亚洲.小檗碱含量测定方法的研究进展[J].青岛医药卫生，2013， 45（5）：359-361.
[5] 赖先荣，周邦华，杜明胜，等.6种黄连饮片中6种生物碱的RP-HPLC含量测定及与“治消渴”药效学的谱-效关系分析[J].中国中药杂志，2016， 41（24）：4579-4586.
[6] 高聪聪，许闽，周悌强，等.四方胃胶囊中盐酸小檗碱的含量测定[J].中医学报，2013，28（12）：1860-1861.
[7] 陆静娴，谭春梅，陈碧莲，等.明目上清丸质量标准改进[J].药物分析杂志，2016，36（11）：2051-2058.
（收稿日期：2017-09-25）
（修回日期：2018-01-02；编辑：陈静）
关键词：肝豆灵片；黄连有效成分；高效液相色谱法；定性分析；定量分析
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0087-03
Qualitative and Quantitative Analysis of Active Components of Copditis Rhizoma in Gandouling Pills by HPLC
CHEN Li， WANG Sheng， QIN Xiu-juan， MENG Mei
The First Affiliated Hospital of Anhui College of TCM， State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China
Abstract： Objective To optimize the HPLC conditions for active components of Coptidis Rhizoma； To establish qualitative and quantitative analysis method for related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. Methods HPLC was used for the qualitative and quantitative analysis of related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. With acetonitrile： 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution = 50：50 （per 100 mL was added 0.4 g sodium dodecyl sulfate， and then adjusted pH to 4.0 with phosphoric acid） as mobile phase， the flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 345 nm. Results Four components of Coptidis Rhizoma can be identified， including berberine， coptisine， berberine hydrochloride and palmatine chloride， and the negative control had no disturbance. Berberine hydrochloride reference and the absorbance peak area value showed a good linear relationship within 0.058–0.580 μg sample volume， and palmatine chloride reference was the same within 0.030–0.300 μg sample volume. The average recovery was 98.18% and 99.99%， and RSD was 2.40% and 1.70%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and with good repeatability， which can be applied effectively to the quality control of Gandouling Pills.
Keywords： Gandouling Pills； active components of Coptidis Rhizoma； HPLC； qualitative analysis； quantitative analysis
作為国家重大疑难病防治中心和国家中医药管理局肝豆状核变性协作组组长单位，安徽中医药大学第一附属医院脑病中心专家根据长期临床实践，认为痰瘀互结贯穿于该病始终，提出以化痰祛瘀为治法，总结出具有祛痰化瘀、软坚散结功效的医院制剂肝豆灵片（皖药制字Z20050071），该制剂在临床使用20余年，在改善肝豆状核变性患者神经功能方面取得良好疗效。为保证该制剂临床使用的安全性和疗效的稳定性，本研究建立方中臣药黄连主要有效成分的HPLC测定方法，以有效控制本品质量。
1 仪器与试药 Agilent1260高效液相色谱仪（DAD紫外检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置和自动进样器），Analytical C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），超声波清洗器（SK3200H，天津天有利科技有限公司），电子天平（Sartorius BP211D）。
肝豆灵片（批号20170609、20170310、20161024、20160703、20160318、20151123），安徽省中医院制剂室；小檗碱对照品（批号110713-201212），中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，屈臣蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液
精密称取盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品适量，加甲醇制成每毫升含盐酸小檗碱0.029 mg、盐酸巴马汀0.060 mg的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液
取本品粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1∶100）50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用盐酸-甲醇（1∶100）补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液
取缺黄连的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.2 色谱条件与系统适用性试验
采用Analytical C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液=50∶50（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0），检测波长345 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min。吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪测定。理论塔板数按小檗碱峰计算n=12 442，分离度R=3.18，拖尾因子T=0.99，均符合药典规定。
2.3 黄连相关成分定性分析
分别吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定，结果供试品色谱中依次出现4个含量较高的色谱峰（保留时间分别为14.119、1.639、18.767、20.888 min）。色谱图见图1。以小檗碱为参照，4个色谱峰的相对保留时间（见表1）与2015年版《中华人民共和国药典》黄连项下含量测定项中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱保留时间规定值[1]的误差均小于5%，符合要求。因此，可以初步验证供试品色谱呈现的4个色谱峰分别为黄连相关成分表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱。1、2号峰保留时间分别与盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品溶液一致，且阴性对照无干扰，从而进一步验证1、2、3、4号峰分别为小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱。
2.4 盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量测定
2.4.1 标准曲线的绘制
分别精密吸取0.029 mg/mL盐酸小檗碱对照品溶液2、4、6、8、16、20 μL，0.006 mg/mL盐酸巴马汀对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 μL，依次注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，分别以盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的进样量为横坐标，相应的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的线性回归方程分别为：Y=4139.522 4X+2.032 2，r=0.999 98；Y=4844.996 8X+7.030 8，r=0.999 96。结果盐酸小檗碱对照品进样量在0.058～0.580 μg、盐酸巴马汀对照品进样量在0.030～0.300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4.2 精密度试验
精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积积分值，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为0.33%、1.10%，表明本法精密度良好。
2.4.3 稳定性试验
取供试品溶液，于室温放置0、2、4、6、8、10 h进样测定，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为0.23%、1.14%，表明供试品溶液中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀在10 h内稳定。
2.4.4 重复性试验
取样品（批号20140307）6份，按含量测定项下方法制备并测定，结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为2.36%、1.48%，表明本法重复性良好。
2.4.5 样品的测定与含量限度的确定
取样品，每批平行3份，分别按含量测定项下方法测定盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量，结果见表2。
2.4.6 加样回收率试验
精密称取已知盐酸小檗碱含量的样品（10.15 mg/g）适量，分别精密加入盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品适量，按含量测定项下方法制备供试品溶液并测定，结果见表3、表4。
3 讨论
本研究建立了肝豆灵片中黄连相关成分HPLC定性定量分析方法，对制剂中黄连的4个成分表小檗碱、黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀进行了定性分析，并对盐酸小檗碱、盐酸巴马汀进行了含量测定。
基于原国家食品药品监督管理局《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》规定以检测方中君臣药、贵重药和毒剧药為主的原则，试验初期设计将方中君药姜黄的主要活性成分姜黄素作为含量测定项质控指标[2]，并对其HPLC含量测定条件进行摸索，结果供试品在与姜黄素对照品色谱峰相应的保留时间无对应峰出现，表明该成分在制剂中含量较低，故未采用姜黄素作为定量指标，而选用含量较高的臣药黄连主要活性成分盐酸小檗碱、盐酸巴马汀作为含量测定指标[3]。制剂中君药主要有效成分含量较低的原因及对整体药效是否有影响，还需进一步探究。
HPLC测定盐酸小檗碱的流动相体系较多。本试验考察了3种流动相体系的色谱分离情况[1，4-7]：①乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）；②乙腈-三乙胺-冰醋酸-水；③乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL中加十二烷基磺酸钠0.1 g）。结果供试品溶液以①为流动相，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与其他成分均能很好地分离，供试品色谱图中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀保留时间与对照品一致，且阴性对照无干扰。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：304.
[2] 崔语涵，安潇，王海峰，等.姜黄化学成分研究[J].中草药，2016，47（7）：1074-1078.
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[4] 王亚洲.小檗碱含量测定方法的研究进展[J].青岛医药卫生，2013， 45（5）：359-361.
[5] 赖先荣，周邦华，杜明胜，等.6种黄连饮片中6种生物碱的RP-HPLC含量测定及与“治消渴”药效学的谱-效关系分析[J].中国中药杂志，2016， 41（24）：4579-4586.
[6] 高聪聪，许闽，周悌强，等.四方胃胶囊中盐酸小檗碱的含量测定[J].中医学报，2013，28（12）：1860-1861.
[7] 陆静娴，谭春梅，陈碧莲，等.明目上清丸质量标准改进[J].药物分析杂志，2016，36（11）：2051-2058.
（收稿日期：2017-09-25）
（修回日期：2018-01-02；编辑：陈静）