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摘要 研究高浓度菲作为底物对彩绒革盖菌产漆酶酶量的影响，结果表明：彩绒革盖菌随着培养时间的变化漆酶酶活量一直上升，当达到最大值6.573 U/mL后开始下降；其生物量的变化趋势与漆酶酶量是一样的，但生物量的最高值要比酶活量的最高值提前3 d产生。
关键词 白腐真菌；彩绒革盖菌；菲；漆酶
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）10-0152-01
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，对底物没有特殊的专一性，关于其去除废水中的染色剂及降解环境中多环芳烃的研究很多，同时也被证实彩绒革盖菌是真菌中漆酶的高产菌株[1]，但是以高浓度且结构复杂有机物为底物时，彩绒革盖菌对其是否能够降解的相关报道尚且很少。该试验的主要目的就是研究彩绒革盖菌在结构复杂高浓度有机物为底物的情况下，是否能分泌漆酶，并确定产漆酶的量。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种来源。试验菌种为保存于东北林业大学环境微生物实验室的彩绒革盖菌（Coriolus uersicolor）。
1.1.2 培养基。固体培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，定容至1 L，自然pH值（用于彩绒革盖菌的扩大培养）。
基础培养基：麸皮20 g/L，氯化铵0.44 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4 0.05 g/L，CaCl2 0.01 g/L，吐温801.0 g/L，无机溶液1 mL/L，维生素溶液0.5 mL/L，自然pH值。
无机溶液：MgSO4·7H2O 3.0 g/L，MnSO4 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CoSO4 0.1 g/L，CaCl2 0.082 g/L，ZnSO4 0.1 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，KAl（SO4）2 0.01 g/L，H3BO3 0.01 g/L，NaMoO4 0.01 g/L。
维生素溶液：V■ 0.005 g/L，V■ 0.005 g/L，生物素0.002 g/L，叶酸0.002 g/L，V■ 0.01 g/L，烟酸0.005 g/L。
1.1.3 主要试剂与仪器。试剂：试剂菲（纯度>95%），生产厂家为天津希恩思生化科技有限公司；丙酮分析纯；称取一定量的菲溶于丙酮中配成500 mg/L丙酮菲溶液作为降解底物；ABTS配置成0.5 mmol/L的溶液；pH值为5的醋酸钠缓冲溶液；去离子水。仪器：恒温培养箱、振荡培养箱、高压灭菌锅、单人净化工作台、高速离心机、移液枪。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株培养。将斜面上生长的彩绒革盖菌经培养箱28 ℃活化3 d后，从斜面接种于含固体培养基的平板上培养7 d后待用。向150 mL锥形瓶中分别加入1 mL丙酮菲溶液，放置通风橱中过夜，待丙酮挥发完毕后取出，各加入50 mL液体培养基，配制成500 mg/L菲溶液，灭菌后，接种菌片，28 ℃、125 r/min摇床培养。每组样品做3个平行，定时取样测定其酶活。
1.2.2 白腐真菌培养条件。该试验以菲为目标污染物，以漆酶为考核指标，测量彩绒革盖菌产漆酶的情况。用直径为10 mm打孔器打3个直径相同的菌片放入灭菌后的含有液体培养基的150 mL三角瓶中，每组样品做3个平行，在28 ℃、125 r/min条件下摇床培养，定期取样测定酶活。
1.3 测定方法
生物量的测定参见文献[2]的方法，漆酶活力的测定参见文献[3]的方法。
2 结果与分析
2.1 彩绒革盖菌产漆酶的情况
在28 ℃、125 r/min条件下，摇床培养彩绒革盖菌，并定时取样测定酶活。其分泌漆酶活性随时间变化先升高，到最高峰时开始下降，趋势均一致，在第21天达到酶活峰值6.573 U/mL，之后随着时间的变化而下降。
2.2 彩绒革盖菌生物量的变化
在28 ℃、125 r/min条件下，测彩绒革盖菌的生物量变化，结果表明：生物量随着时间的变化而升高，在第18天生物量达到最高0.060 3 g，之后开始慢慢下降。
3 结论与讨论
该试验是在多环芳烃菲为底物的情况下培养彩绒革盖菌，目的是证明彩绒革盖菌在高浓度底物的情况下能够分泌漆酶。结果表明：漆酶量随时间变化先升高，到最高峰时开始下降，最高酶活量在第21天产生，漆酶酶活量是6.573 U/mL。生物量在第18天达到最高，最高生物量是0.060 3 g，趋势与漆酶变化相似。从最高酶活与最多生物量产生的时间差可以推出，当生物量达到一定量时，酶活的释放量也随之升高，生物量下降时，酶活的产生量也随之下降，由此可推出彩绒革盖菌生长的好坏对产漆酶酶量有直接的影响，此结论与孟 瑶等[4]的结論相同。但是该试验的彩绒革盖菌所释放的酶活量并不是很高，原因可能是底物结构的不同或是底物浓度过高，其毒性影响了彩绒革盖菌的生长，同时影响了漆酶的释放量[5]。
4 参考文献
[1] 张玉，洪枫.优化彩绒革盖菌产漆酶条件及染料脱色研究[J].林产化学与工业，2006（3）：41-46.
[2] 杜丽娜，高大文.青顶拟多孔菌对单一和复合多环芳烃的降解特性[J].中国环境科学，2011，31（2）：277-282.
[3] BOURBONNAIS R，PAICE M G.Oxidation of non-phenolic substrates：an expanded role for laccase in lignin biodegradation[J].Federation of European Biochemical Societies Letters，1990，267（1）：99-102.
[4] 孟瑶，梁红，高大文.不同白腐真菌复配方式对产酶的影响[J].环境科学，2013，34（1）：271-276.
[5] 卢蓉，沈雪亮，夏黎明.彩绒革盖菌产中漆酶及其对染料脱色的研究[J].林产化学与工业，2005，25（1）：73-76.
关键词 白腐真菌；彩绒革盖菌；菲；漆酶
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）10-0152-01
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，对底物没有特殊的专一性，关于其去除废水中的染色剂及降解环境中多环芳烃的研究很多，同时也被证实彩绒革盖菌是真菌中漆酶的高产菌株[1]，但是以高浓度且结构复杂有机物为底物时，彩绒革盖菌对其是否能够降解的相关报道尚且很少。该试验的主要目的就是研究彩绒革盖菌在结构复杂高浓度有机物为底物的情况下，是否能分泌漆酶，并确定产漆酶的量。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种来源。试验菌种为保存于东北林业大学环境微生物实验室的彩绒革盖菌（Coriolus uersicolor）。
1.1.2 培养基。固体培养基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，定容至1 L，自然pH值（用于彩绒革盖菌的扩大培养）。
基础培养基：麸皮20 g/L，氯化铵0.44 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4 0.05 g/L，CaCl2 0.01 g/L，吐温801.0 g/L，无机溶液1 mL/L，维生素溶液0.5 mL/L，自然pH值。
无机溶液：MgSO4·7H2O 3.0 g/L，MnSO4 0.5 g/L，NaCl 1.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，CoSO4 0.1 g/L，CaCl2 0.082 g/L，ZnSO4 0.1 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，KAl（SO4）2 0.01 g/L，H3BO3 0.01 g/L，NaMoO4 0.01 g/L。
维生素溶液：V■ 0.005 g/L，V■ 0.005 g/L，生物素0.002 g/L，叶酸0.002 g/L，V■ 0.01 g/L，烟酸0.005 g/L。
1.1.3 主要试剂与仪器。试剂：试剂菲（纯度>95%），生产厂家为天津希恩思生化科技有限公司；丙酮分析纯；称取一定量的菲溶于丙酮中配成500 mg/L丙酮菲溶液作为降解底物；ABTS配置成0.5 mmol/L的溶液；pH值为5的醋酸钠缓冲溶液；去离子水。仪器：恒温培养箱、振荡培养箱、高压灭菌锅、单人净化工作台、高速离心机、移液枪。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株培养。将斜面上生长的彩绒革盖菌经培养箱28 ℃活化3 d后，从斜面接种于含固体培养基的平板上培养7 d后待用。向150 mL锥形瓶中分别加入1 mL丙酮菲溶液，放置通风橱中过夜，待丙酮挥发完毕后取出，各加入50 mL液体培养基，配制成500 mg/L菲溶液，灭菌后，接种菌片，28 ℃、125 r/min摇床培养。每组样品做3个平行，定时取样测定其酶活。
1.2.2 白腐真菌培养条件。该试验以菲为目标污染物，以漆酶为考核指标，测量彩绒革盖菌产漆酶的情况。用直径为10 mm打孔器打3个直径相同的菌片放入灭菌后的含有液体培养基的150 mL三角瓶中，每组样品做3个平行，在28 ℃、125 r/min条件下摇床培养，定期取样测定酶活。
1.3 测定方法
生物量的测定参见文献[2]的方法，漆酶活力的测定参见文献[3]的方法。
2 结果与分析
2.1 彩绒革盖菌产漆酶的情况
在28 ℃、125 r/min条件下，摇床培养彩绒革盖菌，并定时取样测定酶活。其分泌漆酶活性随时间变化先升高，到最高峰时开始下降，趋势均一致，在第21天达到酶活峰值6.573 U/mL，之后随着时间的变化而下降。
2.2 彩绒革盖菌生物量的变化
在28 ℃、125 r/min条件下，测彩绒革盖菌的生物量变化，结果表明：生物量随着时间的变化而升高，在第18天生物量达到最高0.060 3 g，之后开始慢慢下降。
3 结论与讨论
该试验是在多环芳烃菲为底物的情况下培养彩绒革盖菌，目的是证明彩绒革盖菌在高浓度底物的情况下能够分泌漆酶。结果表明：漆酶量随时间变化先升高，到最高峰时开始下降，最高酶活量在第21天产生，漆酶酶活量是6.573 U/mL。生物量在第18天达到最高，最高生物量是0.060 3 g，趋势与漆酶变化相似。从最高酶活与最多生物量产生的时间差可以推出，当生物量达到一定量时，酶活的释放量也随之升高，生物量下降时，酶活的产生量也随之下降，由此可推出彩绒革盖菌生长的好坏对产漆酶酶量有直接的影响，此结论与孟 瑶等[4]的结論相同。但是该试验的彩绒革盖菌所释放的酶活量并不是很高，原因可能是底物结构的不同或是底物浓度过高，其毒性影响了彩绒革盖菌的生长，同时影响了漆酶的释放量[5]。
4 参考文献
[1] 张玉，洪枫.优化彩绒革盖菌产漆酶条件及染料脱色研究[J].林产化学与工业，2006（3）：41-46.
[2] 杜丽娜，高大文.青顶拟多孔菌对单一和复合多环芳烃的降解特性[J].中国环境科学，2011，31（2）：277-282.
[3] BOURBONNAIS R，PAICE M G.Oxidation of non-phenolic substrates：an expanded role for laccase in lignin biodegradation[J].Federation of European Biochemical Societies Letters，1990，267（1）：99-102.
[4] 孟瑶，梁红，高大文.不同白腐真菌复配方式对产酶的影响[J].环境科学，2013，34（1）：271-276.
[5] 卢蓉，沈雪亮，夏黎明.彩绒革盖菌产中漆酶及其对染料脱色的研究[J].林产化学与工业，2005，25（1）：73-76.