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【摘要】目的：研究Bmi-1基因沉默对膀胱癌EJ细胞侵袭和转移的影响。方法：用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察Bmi-1 shRNA对膀胱癌EJ细胞侵袭和转移的影响。用RT-PCR方法检测Bmi-1 shRNA对MMP-2 mRNA表达的影响。用Westem Blotting方法检测Bmi-1 shRNA对E-Cadherin和α-SMA表达的影响。结果：Transwell侵袭实验结果显示实验组细胞的穿膜细胞数为（77.0 ±4.8）个，未转染组细胞的穿膜细胞数为（152.1 ±4.3）个，空质粒组细胞的穿膜细胞数为（155.0 ±6.5）个。细胞划痕实验结果显示实验组细胞迁移能力明显降低。RT-PCR结果显示，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒组中MMP-2表达明显升高，而Bmi-1 shRNA组MMP-2表达没有变化。Western结果显示，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒组中E-Cadherin表达明显降低和α-SMA表达明显升高，而Bmi-1 shRNA组E-Cadherin和α-SMA表达没有变化。结论：Bmi-1 shRNA可以抑制膀胱癌EJ细胞侵袭和转移，其机制可能是通过阻断TGF-β促进肿瘤细胞侵袭和转移作用完成的。
【关键词】Bmi-1；EJ细胞；侵袭；转移
【中图分类号】R737.14【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0015-02
shRNA-silenced Bmi-1 gene inhibits the metastasis and invasiveness ofbladder carcinoma EJ cells
Li Chengwen1 Zhu Mingyang1 Li IHui1 Chang Jiwu2
【Abstract】Objective:Blocking the expression of Bmi-1 with shRNA interference techniques，the effects of suppressing the metastasis and invasiveness of human bladder carcinoma EJ cells were investigated.Methods:The ability of migration and invasion of EJ cells were observed by Transwell and Wound closure assay. The expression of MMP-2, E-Cadherin and α-SMA were analyzed by RT-PCR and Western blotting. Results:In invasion experiment, the trans-membrane cell number in pGeneClipTM-Bmi-1 transfected cells was 77.0±4.8, and that in untransfected cells and in blank plasmid transfected cells was 152.1±4.3 and 155.0±6.5 respectively. The migration were inhibited significantly in EJ cells transfected by pGeneClipTM-Bmi-1 compared with that in EJ cells transfected by blank plasmid and untransfected cells. The expression change of MMP-2, E-Cadherin and α-SMA in presence of TGF-β were inhibited in pGeneClipTM-Bmi-1 transfected cells. Conclusion Bmi-1 shRNA suppresses the migration and invasiveness of EJ cells and perform the function through blocking the TGF-β signaling pathway.
【Key words】Bmi-1; EJ cells; invasiveness；metastasis
原癌基因Bmi-1属于多疏基基因家族，在细胞生长、增殖和干细胞自我更新的调节中发挥重要作用。为探讨Bmi-1基因在膀胱癌发生、发展中的作用，我们应用前期已经构建成功的Bmi-1 shRNA质粒，通过降低膀胱癌EJ细胞中的Bmi-1基因表达，观察Bmi-1基因对膀胱癌细胞侵袭和转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料：脂质体lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司； E-Cadherin多克隆抗体、α-SMA单克隆抗体和β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；TGF-β1细胞因子购自美国R&D公司。
1.2 细胞培养与转染：EJ细胞在高糖DMEM培养基于37℃，5% CO2孵箱内培养。转染前分别用无血清DMEM培养基稀释重组质粒和lipofectamine2000。每孔分别加入2μg质粒及10μl lipofectamine2000。实验细胞分为3组：未转染组、空质粒组和转染Bmi-1 shRNA质粒的实验组。
1.3 细胞划痕试验：将EJ细胞接种于6孔板内培养，于5% CO2培养箱内37℃孵育24 h后，用无菌200 μl 尖头垂直划出一无细胞的细痕，制作培养细胞伤口模型。孵育48 h后，10倍倒置显微镜下观察划痕处细胞的覆盖情况。
1.4 Transwell侵袭实验：用50 mg/L Matrigel稀释包被Transwell小室底部。加600μl含10%FBS的DMEM培养液，置37℃、5% CO2孵箱培养48h。取出小室弃除上室液体，用棉签擦尽上室膜面未穿膜的细胞，随后以甲苯胺蓝染液染色。镜下随机选择5个200倍视野，统计视野中的细胞总数，取其平均值。每组重复3次。
1.5 RT-PCR检测EJ细胞中MMP2的表达：收集转染48 h细胞，提取细胞总RNA，以β-actin为内参照。以RT-PCR法检测在预先加入TGF-β1细胞因子干预下MMP2基因mRNA表达的改变。
1.6 Westem blot检测EJ细胞中E-Cadherin和α-SMA表达：6孔板细胞转染后72 h，收集分组提取总蛋白；按每孔40μg上样，进行SDS-PAGE垂直电泳，将电泳分离后的蛋白电转至PVDF膜。ECL法显影。以β-actin为内参照。
1.7 统计学方法：实验数据计量资料以表示，应用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析。检验水准α0.05。
2 结果
2.1 细胞划痕实验检测Bmi-1 shRNA对膀胱癌EJ细胞迁移能力的影响：划痕48h后未转染组和空质粒对照组两侧细胞大部分已经接近融合，而实验组48 h后融合趋势仍不明显（图1）。
2.2 Transwell小室检测Bmi-1 shRNA对膀胱癌EJ细胞侵袭能力的影响：实验组细胞的穿膜细胞数为（77.0 ±4.8）个。未转染组细胞的穿膜细胞数为（152.1±4.3）个。空质粒组细胞的穿膜细胞数为（155.0 ±6.5）个（图2）。实验组与其他两组比较差异均有统计学意义（p<0.01），未转染组与空质粒对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3 Bmi-1 shRNA对MMP-2 mRNA表达的影响：RT-PCR结果显示，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒对照组中MMP-2表达明显升高，而Bmi-1 shRNA实验组MMP-2表达没有变化（图3）。
2.4 Bmi-1 shRNA对E-Cadherin和α-SMA表达的影响：Western结果显示，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒对照组中E-Cadherin表达明显降低，而Bmi-1 shRNA实验组E-Cadherin表达没有变化；空白组和对照组中α-SMA表达明显升高，而Bmi-1 shRNA实验组α-SMA表达没有变化（图4）。
3 讨论
原癌基因Bmi-1在人类的多种肿瘤中异常表达，并与多种肿瘤发生相关。在前期研究中，我们发现当膀胱癌细胞中Bmi-1蛋白质的表达受到抑制后，膀胱癌5637细胞的增殖受到抑制，同时细胞凋亡明显增加[1]。为进一步探讨Bmi-1基因在膀胱癌发生、发展中的作用，我们构建了Bmi-1 shRNA质粒，以此观察Bmi-1基因对膀胱癌侵袭和转移的影响。
我们应用Transwell侵袭实验和细胞划痕实验发现，转染Bmi-1 shRNA质粒后，膀胱癌EJ细胞的侵袭和转移能力都明显降低。因此，说明Bmi-1基因本身可以促进膀胱肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。另外，基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质，并能够通过降解Ⅳ型胶原来降解基底膜，而基底膜的降解是肿瘤浸润和转移的关键步骤[3]。TGF-β细胞因子在肿瘤细胞中可诱导表达血管内皮生长因子、金属蛋白酶MMP 2和MMP 9等，有利于肿瘤细胞的浸润和转移[4]。本次研究发现当膀胱癌EJ细胞中的Bmi-1基因表达降低时，可以阻断TGF-β这种上调MMP2表达作用。
E-Cadherin是上皮细胞膜表达的重要分子，其可以抑制肿瘤的转移；α-SMA是间叶细胞主要标志性分子，在肿瘤发展的晚期阶段，肿瘤细胞可以产生大量的TGF-β细胞因子，其可以提高α-SMA表达并可以降低E-Cadherin表达，破坏细胞骨架蛋白完整性，促进肿瘤细胞侵袭和转移[5]。本次研究结果发现，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒对照组中E-Cadherin表达明显降低，而Bmi-1 shRNA实验组E-Cadherin表达没有变化；空白组和对照组中α-SMA表达明显升高，而Bmi-1 shRNA实验组α-SMA表达没有变化。这一结果表明，当膀胱癌EJ细胞中的Bmi-1基因表达降低时，可以阻断TGF-β这种促进肿瘤细胞侵袭和转移作用。因此，针对Bmi-1的靶向治疗将有可能成为膀胱肿瘤基因治疗的一个新方向。
参考文献
[1] 李成文,孙光,畅继武,等.shRNA干扰Bmi-1基因表达载体构建及其对膀胱癌5637细胞增殖抑制作用的研究[J] .中华肿瘤防治杂志,2010,17（11）:835-838
[2] Xiao J, Deng C. Knockdown of Bmi-1 impairs growth and invasiveness of human gastric carcinoma cells. Oncol Res, 2009, 17:613-620
[3] Belotti D, Paganoni P, Manenti L, et al. Matrix metalloproteinases （MMP9 and MMP2） induce the release of vascular endothelial growth factor （VEGF） by ovarian carcinoma cells: implications for ascites formation. Cancer Res, 2003, 63:5224-5229
[4] Kim ES, Kim MS, Moon A.TGF-beta-induced upregulation of MMP-2 and MMP-9 depends on p38 MAPK, but not ERK signaling in MCF10A human breast epithelial cells. Int J Oncol, 2004, 25:1375-1382
[5] Kondo M, Cubillo E, Tobiume K, et al. A role for Id in the regulation of TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transdifferentiation. Cell Death Differ, 2004, 11:1092-1101
【关键词】Bmi-1；EJ细胞；侵袭；转移
【中图分类号】R737.14【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0015-02
shRNA-silenced Bmi-1 gene inhibits the metastasis and invasiveness ofbladder carcinoma EJ cells
Li Chengwen1 Zhu Mingyang1 Li IHui1 Chang Jiwu2
【Abstract】Objective:Blocking the expression of Bmi-1 with shRNA interference techniques，the effects of suppressing the metastasis and invasiveness of human bladder carcinoma EJ cells were investigated.Methods:The ability of migration and invasion of EJ cells were observed by Transwell and Wound closure assay. The expression of MMP-2, E-Cadherin and α-SMA were analyzed by RT-PCR and Western blotting. Results:In invasion experiment, the trans-membrane cell number in pGeneClipTM-Bmi-1 transfected cells was 77.0±4.8, and that in untransfected cells and in blank plasmid transfected cells was 152.1±4.3 and 155.0±6.5 respectively. The migration were inhibited significantly in EJ cells transfected by pGeneClipTM-Bmi-1 compared with that in EJ cells transfected by blank plasmid and untransfected cells. The expression change of MMP-2, E-Cadherin and α-SMA in presence of TGF-β were inhibited in pGeneClipTM-Bmi-1 transfected cells. Conclusion Bmi-1 shRNA suppresses the migration and invasiveness of EJ cells and perform the function through blocking the TGF-β signaling pathway.
【Key words】Bmi-1; EJ cells; invasiveness；metastasis
原癌基因Bmi-1属于多疏基基因家族，在细胞生长、增殖和干细胞自我更新的调节中发挥重要作用。为探讨Bmi-1基因在膀胱癌发生、发展中的作用，我们应用前期已经构建成功的Bmi-1 shRNA质粒，通过降低膀胱癌EJ细胞中的Bmi-1基因表达，观察Bmi-1基因对膀胱癌细胞侵袭和转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料：脂质体lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司； E-Cadherin多克隆抗体、α-SMA单克隆抗体和β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；TGF-β1细胞因子购自美国R&D公司。
1.2 细胞培养与转染：EJ细胞在高糖DMEM培养基于37℃，5% CO2孵箱内培养。转染前分别用无血清DMEM培养基稀释重组质粒和lipofectamine2000。每孔分别加入2μg质粒及10μl lipofectamine2000。实验细胞分为3组：未转染组、空质粒组和转染Bmi-1 shRNA质粒的实验组。
1.3 细胞划痕试验：将EJ细胞接种于6孔板内培养，于5% CO2培养箱内37℃孵育24 h后，用无菌200 μl 尖头垂直划出一无细胞的细痕，制作培养细胞伤口模型。孵育48 h后，10倍倒置显微镜下观察划痕处细胞的覆盖情况。
1.4 Transwell侵袭实验：用50 mg/L Matrigel稀释包被Transwell小室底部。加600μl含10%FBS的DMEM培养液，置37℃、5% CO2孵箱培养48h。取出小室弃除上室液体，用棉签擦尽上室膜面未穿膜的细胞，随后以甲苯胺蓝染液染色。镜下随机选择5个200倍视野，统计视野中的细胞总数，取其平均值。每组重复3次。
1.5 RT-PCR检测EJ细胞中MMP2的表达：收集转染48 h细胞，提取细胞总RNA，以β-actin为内参照。以RT-PCR法检测在预先加入TGF-β1细胞因子干预下MMP2基因mRNA表达的改变。
1.6 Westem blot检测EJ细胞中E-Cadherin和α-SMA表达：6孔板细胞转染后72 h，收集分组提取总蛋白；按每孔40μg上样，进行SDS-PAGE垂直电泳，将电泳分离后的蛋白电转至PVDF膜。ECL法显影。以β-actin为内参照。
1.7 统计学方法：实验数据计量资料以表示，应用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析。检验水准α0.05。
2 结果
2.1 细胞划痕实验检测Bmi-1 shRNA对膀胱癌EJ细胞迁移能力的影响：划痕48h后未转染组和空质粒对照组两侧细胞大部分已经接近融合，而实验组48 h后融合趋势仍不明显（图1）。
2.2 Transwell小室检测Bmi-1 shRNA对膀胱癌EJ细胞侵袭能力的影响：实验组细胞的穿膜细胞数为（77.0 ±4.8）个。未转染组细胞的穿膜细胞数为（152.1±4.3）个。空质粒组细胞的穿膜细胞数为（155.0 ±6.5）个（图2）。实验组与其他两组比较差异均有统计学意义（p<0.01），未转染组与空质粒对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3 Bmi-1 shRNA对MMP-2 mRNA表达的影响：RT-PCR结果显示，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒对照组中MMP-2表达明显升高，而Bmi-1 shRNA实验组MMP-2表达没有变化（图3）。
2.4 Bmi-1 shRNA对E-Cadherin和α-SMA表达的影响：Western结果显示，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒对照组中E-Cadherin表达明显降低，而Bmi-1 shRNA实验组E-Cadherin表达没有变化；空白组和对照组中α-SMA表达明显升高，而Bmi-1 shRNA实验组α-SMA表达没有变化（图4）。
3 讨论
原癌基因Bmi-1在人类的多种肿瘤中异常表达，并与多种肿瘤发生相关。在前期研究中，我们发现当膀胱癌细胞中Bmi-1蛋白质的表达受到抑制后，膀胱癌5637细胞的增殖受到抑制，同时细胞凋亡明显增加[1]。为进一步探讨Bmi-1基因在膀胱癌发生、发展中的作用，我们构建了Bmi-1 shRNA质粒，以此观察Bmi-1基因对膀胱癌侵袭和转移的影响。
我们应用Transwell侵袭实验和细胞划痕实验发现，转染Bmi-1 shRNA质粒后，膀胱癌EJ细胞的侵袭和转移能力都明显降低。因此，说明Bmi-1基因本身可以促进膀胱肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。另外，基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质，并能够通过降解Ⅳ型胶原来降解基底膜，而基底膜的降解是肿瘤浸润和转移的关键步骤[3]。TGF-β细胞因子在肿瘤细胞中可诱导表达血管内皮生长因子、金属蛋白酶MMP 2和MMP 9等，有利于肿瘤细胞的浸润和转移[4]。本次研究发现当膀胱癌EJ细胞中的Bmi-1基因表达降低时，可以阻断TGF-β这种上调MMP2表达作用。
E-Cadherin是上皮细胞膜表达的重要分子，其可以抑制肿瘤的转移；α-SMA是间叶细胞主要标志性分子，在肿瘤发展的晚期阶段，肿瘤细胞可以产生大量的TGF-β细胞因子，其可以提高α-SMA表达并可以降低E-Cadherin表达，破坏细胞骨架蛋白完整性，促进肿瘤细胞侵袭和转移[5]。本次研究结果发现，与不加TGF-β组相比，TGF-β作用后，未转染组和空质粒对照组中E-Cadherin表达明显降低，而Bmi-1 shRNA实验组E-Cadherin表达没有变化；空白组和对照组中α-SMA表达明显升高，而Bmi-1 shRNA实验组α-SMA表达没有变化。这一结果表明，当膀胱癌EJ细胞中的Bmi-1基因表达降低时，可以阻断TGF-β这种促进肿瘤细胞侵袭和转移作用。因此，针对Bmi-1的靶向治疗将有可能成为膀胱肿瘤基因治疗的一个新方向。
参考文献
[1] 李成文,孙光,畅继武,等.shRNA干扰Bmi-1基因表达载体构建及其对膀胱癌5637细胞增殖抑制作用的研究[J] .中华肿瘤防治杂志,2010,17（11）:835-838
[2] Xiao J, Deng C. Knockdown of Bmi-1 impairs growth and invasiveness of human gastric carcinoma cells. Oncol Res, 2009, 17:613-620
[3] Belotti D, Paganoni P, Manenti L, et al. Matrix metalloproteinases （MMP9 and MMP2） induce the release of vascular endothelial growth factor （VEGF） by ovarian carcinoma cells: implications for ascites formation. Cancer Res, 2003, 63:5224-5229
[4] Kim ES, Kim MS, Moon A.TGF-beta-induced upregulation of MMP-2 and MMP-9 depends on p38 MAPK, but not ERK signaling in MCF10A human breast epithelial cells. Int J Oncol, 2004, 25:1375-1382
[5] Kondo M, Cubillo E, Tobiume K, et al. A role for Id in the regulation of TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transdifferentiation. Cell Death Differ, 2004, 11:1092-1101