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[摘要]目的：探讨ADSCs复合HA促进裸鼠背部软组织血管化的实验研究 方法：根据所选材料不同，将实验分为三组，A组为ADSCs复合HA，B组为ADSCs复合脂肪颗粒，C组为单纯ADSCs，分别将3组试剂随机注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3个点，3个月后获取相应标本，观察相应指标。结果：①大体观察：A组组织块吸收最少，B组组织块吸收较少，C组组织块基本吸收最多；②湿重测定：A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意（P<0.05）；③存活率比较（%）：A组明显高于B、C组，且差异有统计学意（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）；④微血管密度（MVD）：A组明显高于B、C组，差异有统计学意义（P<0.01），B组高于略高于C组，差异有统计学意义（P<0.01）；结论：HA作为生物支架复合ADSCs可加速裸鼠软组织血管化的形成，为整形美容外科脂肪干细胞移植中生物支架的选择提供理论依据。
[关键词]透明质酸；脂肪干细胞；生物支架；血管化；整形美容外科
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1076-03
自体脂肪移植是理想的修复软组织缺损的方法，但移植的脂肪组织成活率低，限制了其在临床上的推广应用[1-2]。脂肪干细胞生物支架复合物是指在脂肪干细胞移植过程中加入相应生物支架，可用来促进移植部位的血管化作用，来提高游离组织的存活率。本研究主要探讨透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为生物支架与脂肪来源干细胞（adipose tissues derived stem cells，ADSCs）混合后对裸鼠背部软组织血管化的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验试剂及主要仪器：II型胶原酶、DMEM培养液、血清、pbs液、胰蛋白酶、碱性成纤维细胞生长因子、组织匀浆机、纯水系统、恒温CO2培养箱、低温台式离心机、精密天平、恒温摇床、倒置相差显微镜、超净工作台、培养瓶、离心管、脂肪抽吸针等吸脂手术器械。支架材料：透明质酸钠（Sigma，美国）；脂肪组织来源于临床吸脂病人抽取组织。抽取为双下肢股外侧及股后侧脂肪，患者对本实验知情并自愿捐献自体脂肪组织100ml用于本研究。
1.1.2 实验动物：裸鼠10只，3W，平均体质量15g，雄性，由河南科技大学医学院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.2 实验设计及方法
1.2.1 干细胞的分离与培养：胶原酶消化脂肪，分离收集原代ADSCs置DMEM培养液传代，收集第3代细胞作为种子细胞。ADSCs按4×105有核细胞/ml细胞密度接种于培养瓶内，常用的75mm塑料培养瓶接种细胞3×107左右，加入低糖DMEM+10%FBS培养液培养，传代收集第3代细胞作为种子细胞，DII荧光标记。
1.2.2 干细胞一生物支架复合物制备、植入和取材： 根据所选材料不同，将实验分为3组，A组将ADSCs按1：1比例与HA混合，B组将ADSCs按1：1比例与脂肪颗粒混合，C组为单纯ADSCs，分别将3组试剂按0.2ml（0.2cm3）随机注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3个点，3个月后获取相应标本，并行免疫组化染色。
1.2.3 观察：①大体观察：肉眼观察各组织块间体积的大小；②湿重：沿移植物被膜外分离，完整取出移植物，立即以电子天平称湿重；③存活率：存活率=术后复合组织块湿重/术前复合组织块湿重；④微血管密度（MVD）：各实验组根据CD31免疫组化染色结果，免疫组化染色图片其阳性表达区域一般为黄色或棕黄色，因此采用Image-Pro Plus 图像分析软件进行半定量分析，每组选取6张（×200）不同视野的免疫组织化学染色图片比较各组微血管生成情况，并根据图像分析软件测量结果进行相关统计分析。
1.2.4 统计学方法：数据采用 SPSS18.0统计软件进行分析。采用LSDt检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1大体观察：各实验组体积变化呈现一定的规律性，不同实验组变化出现较大的波动，A组组织块吸收最少，B组吸收较少，C组组织块吸收最多。术后A、B、C、D四组组织块体积分别为0.172cm3、0.147cm3、0.109cm3：A组组织块明显大于B、C组。
2.2 湿重测定：A、B、C分别为：（0.076±0.006）g、（0.052±0.007）g、（0.021±0.002）g，A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 存活率比较（%）：A、B、C组成活率分别为：（86.00±4.10）%、（73.50±5.17）%、（62.00±4.16）%。A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 微血管密度（IOD）：A、B、C组分别为88.19±11.21、56.23±10.08、21.22±10.72，D组为：65.24±7.71，见图1A、B、C。A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、表2。
3 讨论
自2001年[3]发现ADSCs以来，科研人员使用不同的诱导因子将其诱导分化为不同的组织细胞。Zuk等[3]最早发现它可以向脂肪细胞、成骨细胞分化。随后的研究表明ADSCs不仅可以分化为中胚层的细胞系，还可以分化为外胚层的神经细胞以及内胚层的血管内皮细胞等。ASCs取材容易、来源丰富，与骨髓间充质干细胞（Bone marow derived stromal/stem cells， BMSCs）一样具有自我更新能力、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征，并且具有稳定生长和增殖、促进组织修复的能力，促进移植物的血管化，提高存活率。ASCs在已经在整形外科领域已经应用较多，如自体脂肪移植、促进创面愈合等，因此，关于ASCs的研究成为医学研究的热点之一[4]，其已成为组织工程中较常用的理想的种子细胞[5]。 非动物源性的透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种天然的高分子多糖，是世界上公认的保湿剂，HA很容易发生降解，透明质酸具有非抗原性，很少引起炎症和异物反应因其无致敏性、容易获得且本身就是细胞基质成分，作为组织工程支架具有广阔的前景[3]。之前已经有研究发现透明质酸钠可作为生物支架并与脂肪干细胞混合，并具有一定的协同作用[7]。
故本实验应用组织工程技术，将透明质酸钠做为支架材料，与 ADSCs混合成复合物，探讨其在小鼠软组织中促进其血管化的研究，笔者发现，与无支架的单纯脂肪干细胞或与以脂肪颗粒为支架的复合物相比，脂肪干细胞-透明质酸钠复合物在裸鼠软组织中血管化作用比较明显，其血管数量较多、结构较典型，为脂肪干细胞-透明质酸钠复合物可加速小鼠软组织血管化的形成及其血管化程度提供客观数据，从而证明透明质酸钠作为组织工程中生物支架的可行性，为临床脂肪干细胞移植中生物支架的选择提供理论依据，并为整形美容外科提供一种新的修复材料。
[参考文献]
[1]Patrick CW Jr.Adipose tissue engineering： the future of breast and soft tissue reconstruction following tumor resection[J]. Semin Surg Oncol，2000，19（3）：302-311.
[2]杨波，沈宏亮，徐志飞，等.脂肪组织来源干细胞可促进脂肪移植物的存活率[J].中国组织工程研究， 2012，16（19）：3492- 3494.
[3]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et a1.Multilineage cells from human adipose tissue：Implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：21 1-228.
[4]赵建辉，易成刚，郭树忠，等.脂肪来源干细胞的基础研究进展[J].中国美容医学，2011，20（3）：512-514.
[5]Sumi M，Sata M，Toya N，et al.Transplantation ofadipose stromal cells，but notmature adipocytes，augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sciences，2007，80（26）：559-565.
[6]Sumi M，Sata M，Toya N，et al.Transplantation ofadipose stromal cells，but notmature adipocytes，augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sciences，2007，80（26）：559-565.
[7]Awad Wicldmm MQ，Leddy.Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose alginate andgelatin scaffolds[J].Biomaterials，2004，25：3211-3222.
[收稿日期]2013-03-23 [修回日期]2013-05-02
编辑/张惠娟
[关键词]透明质酸；脂肪干细胞；生物支架；血管化；整形美容外科
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1076-03
自体脂肪移植是理想的修复软组织缺损的方法，但移植的脂肪组织成活率低，限制了其在临床上的推广应用[1-2]。脂肪干细胞生物支架复合物是指在脂肪干细胞移植过程中加入相应生物支架，可用来促进移植部位的血管化作用，来提高游离组织的存活率。本研究主要探讨透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为生物支架与脂肪来源干细胞（adipose tissues derived stem cells，ADSCs）混合后对裸鼠背部软组织血管化的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验试剂及主要仪器：II型胶原酶、DMEM培养液、血清、pbs液、胰蛋白酶、碱性成纤维细胞生长因子、组织匀浆机、纯水系统、恒温CO2培养箱、低温台式离心机、精密天平、恒温摇床、倒置相差显微镜、超净工作台、培养瓶、离心管、脂肪抽吸针等吸脂手术器械。支架材料：透明质酸钠（Sigma，美国）；脂肪组织来源于临床吸脂病人抽取组织。抽取为双下肢股外侧及股后侧脂肪，患者对本实验知情并自愿捐献自体脂肪组织100ml用于本研究。
1.1.2 实验动物：裸鼠10只，3W，平均体质量15g，雄性，由河南科技大学医学院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.2 实验设计及方法
1.2.1 干细胞的分离与培养：胶原酶消化脂肪，分离收集原代ADSCs置DMEM培养液传代，收集第3代细胞作为种子细胞。ADSCs按4×105有核细胞/ml细胞密度接种于培养瓶内，常用的75mm塑料培养瓶接种细胞3×107左右，加入低糖DMEM+10%FBS培养液培养，传代收集第3代细胞作为种子细胞，DII荧光标记。
1.2.2 干细胞一生物支架复合物制备、植入和取材： 根据所选材料不同，将实验分为3组，A组将ADSCs按1：1比例与HA混合，B组将ADSCs按1：1比例与脂肪颗粒混合，C组为单纯ADSCs，分别将3组试剂按0.2ml（0.2cm3）随机注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3个点，3个月后获取相应标本，并行免疫组化染色。
1.2.3 观察：①大体观察：肉眼观察各组织块间体积的大小；②湿重：沿移植物被膜外分离，完整取出移植物，立即以电子天平称湿重；③存活率：存活率=术后复合组织块湿重/术前复合组织块湿重；④微血管密度（MVD）：各实验组根据CD31免疫组化染色结果，免疫组化染色图片其阳性表达区域一般为黄色或棕黄色，因此采用Image-Pro Plus 图像分析软件进行半定量分析，每组选取6张（×200）不同视野的免疫组织化学染色图片比较各组微血管生成情况，并根据图像分析软件测量结果进行相关统计分析。
1.2.4 统计学方法：数据采用 SPSS18.0统计软件进行分析。采用LSDt检验进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1大体观察：各实验组体积变化呈现一定的规律性，不同实验组变化出现较大的波动，A组组织块吸收最少，B组吸收较少，C组组织块吸收最多。术后A、B、C、D四组组织块体积分别为0.172cm3、0.147cm3、0.109cm3：A组组织块明显大于B、C组。
2.2 湿重测定：A、B、C分别为：（0.076±0.006）g、（0.052±0.007）g、（0.021±0.002）g，A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 存活率比较（%）：A、B、C组成活率分别为：（86.00±4.10）%、（73.50±5.17）%、（62.00±4.16）%。A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 微血管密度（IOD）：A、B、C组分别为88.19±11.21、56.23±10.08、21.22±10.72，D组为：65.24±7.71，见图1A、B、C。A组明显高于B、C组，且差异有统计学意义（P<0.01），B组高于C组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、表2。
3 讨论
自2001年[3]发现ADSCs以来，科研人员使用不同的诱导因子将其诱导分化为不同的组织细胞。Zuk等[3]最早发现它可以向脂肪细胞、成骨细胞分化。随后的研究表明ADSCs不仅可以分化为中胚层的细胞系，还可以分化为外胚层的神经细胞以及内胚层的血管内皮细胞等。ASCs取材容易、来源丰富，与骨髓间充质干细胞（Bone marow derived stromal/stem cells， BMSCs）一样具有自我更新能力、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征，并且具有稳定生长和增殖、促进组织修复的能力，促进移植物的血管化，提高存活率。ASCs在已经在整形外科领域已经应用较多，如自体脂肪移植、促进创面愈合等，因此，关于ASCs的研究成为医学研究的热点之一[4]，其已成为组织工程中较常用的理想的种子细胞[5]。 非动物源性的透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种天然的高分子多糖，是世界上公认的保湿剂，HA很容易发生降解，透明质酸具有非抗原性，很少引起炎症和异物反应因其无致敏性、容易获得且本身就是细胞基质成分，作为组织工程支架具有广阔的前景[3]。之前已经有研究发现透明质酸钠可作为生物支架并与脂肪干细胞混合，并具有一定的协同作用[7]。
故本实验应用组织工程技术，将透明质酸钠做为支架材料，与 ADSCs混合成复合物，探讨其在小鼠软组织中促进其血管化的研究，笔者发现，与无支架的单纯脂肪干细胞或与以脂肪颗粒为支架的复合物相比，脂肪干细胞-透明质酸钠复合物在裸鼠软组织中血管化作用比较明显，其血管数量较多、结构较典型，为脂肪干细胞-透明质酸钠复合物可加速小鼠软组织血管化的形成及其血管化程度提供客观数据，从而证明透明质酸钠作为组织工程中生物支架的可行性，为临床脂肪干细胞移植中生物支架的选择提供理论依据，并为整形美容外科提供一种新的修复材料。
[参考文献]
[1]Patrick CW Jr.Adipose tissue engineering： the future of breast and soft tissue reconstruction following tumor resection[J]. Semin Surg Oncol，2000，19（3）：302-311.
[2]杨波，沈宏亮，徐志飞，等.脂肪组织来源干细胞可促进脂肪移植物的存活率[J].中国组织工程研究， 2012，16（19）：3492- 3494.
[3]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et a1.Multilineage cells from human adipose tissue：Implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：21 1-228.
[4]赵建辉，易成刚，郭树忠，等.脂肪来源干细胞的基础研究进展[J].中国美容医学，2011，20（3）：512-514.
[5]Sumi M，Sata M，Toya N，et al.Transplantation ofadipose stromal cells，but notmature adipocytes，augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sciences，2007，80（26）：559-565.
[6]Sumi M，Sata M，Toya N，et al.Transplantation ofadipose stromal cells，but notmature adipocytes，augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sciences，2007，80（26）：559-565.
[7]Awad Wicldmm MQ，Leddy.Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose alginate andgelatin scaffolds[J].Biomaterials，2004，25：3211-3222.
[收稿日期]2013-03-23 [修回日期]2013-05-02
编辑/张惠娟