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目的
针对编码大肠杆菌志贺毒素由位于STEC染色体上的前噬菌体携带的stx基因和O157抗原编码基因rfbe设计特异性引物,并对反应体系和反应条件进行优化,建立一种针对肠出血性大肠杆菌及其毒素的环介导等温扩增(LAMP)反应技术检测法。
方法通过优化LAMP反应的各影响因素,确定LAMP反应体系和反应条件并利用已优化的LAMP体系进行相关检测。
结果确定LAMP反应体系为:内引物(FIP、BIP)与外引物(F3、B3)的比例为8∶1,Mg2+浓度10 mmol/L,dNTPs浓度1.2 mmol/L,甜菜碱浓度0.4 mol/L,Bst DNA聚合酶的添加量为1 μl。LAMP反应时间为60 min,反应温度为60 ℃。以PCR法作为对照,LAMP检测的敏感度为5×101 CFU/mL,PCR的敏感度为5×104 CFU/mL。同时,研究应用所建立的LAMP快速检测法对部分革兰阳性和阴性菌及102株O157大肠杆菌进行快速检测。结果显示,检测特异度达100%,O157大肠杆菌rfbe检出率为100%(102/102),stx1检出率为95.2%(59/62),stx2检出率为92.9%(52/56)。
结论成功建立了一种可应用于肠出血性大肠杆菌及其毒素的敏感、特异的LAMP检测方法。