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摘要：试验以3个细管冻精稀释液配方为基础，进行配方初选试验、不同防冻剂比较试验、同一防冻剂不同含量比较试验，比较了不同条件下细管冻精的制作效果，进而筛选出效果较好的辽西驴细管冻精稀释液配方。
关键词：辽西驴;冷冻精液;稀释液配方
中图分类号：S822 文献标识码：B
doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2019.21.008
0 引言
随着辽西驴饲养数量的增加，对辽西驴肉用品种进行种源选育、加强保种工作提上日程，为防止近交退化、杂交乱配造成的群体退化、生产性能下降，项目组于2019年6-8月开展辽西驴细管冷冻精液的制作研究，为提高辽西驴细管冻精的制作效果，在试验初期开展了辽西驴细管冷冻精液稀释液配方筛选试验，结果、结论如下。
1 材料与方法
1.1 精液来源
研究中使用的精液来源于建平县芮林牧业有限公司的4头种公驴。
1.2 试验药品
主要为分析纯无机盐、糖类、乙二醇、甘油[1]等试剂及抗菌素等。
1.3 试验器材
400～600倍光学显微镜[2]、离心机、恒温水浴锅、超低温温度仪、控温冰箱、电子天平、0.5 mL与0.25 mL细管[3]等。
1.4 试验方法
1.4.1 筛选冷冻稀释液
冷冻稀释液包括以乙二醇为防冻剂的初选配方;以等量甘油替代乙二醇为防冻剂的二次筛选配方;不同含量的防冻剂的优化配方。各配方具体成分如表1、表2、表3。
1.4.2 稀释溶液配制
原精离心液配制：蔗糖分析纯试剂110g，加蒸馏水1000mL煮沸至蔗糖全部溶解。
冷冻稀释液配制：准桷称量各配方中的基础试剂煮沸溶解制成溶液，常温冷却后加入抗菌素和卵黄，搅拌均匀。
1.4.3 精液离心与稀释2
原精经纱布（6～8层）过滤后，按1：1体积比例加入离心液，缓慢均匀混合后，装入离心管，在（30±4） ℃范围内以2000r/min离心10 min;离心后精液弃去上清液后在干净的容器内按1：1～1：2比例加入冷冻稀释液，等温缓慢混匀。
1.4.4 降温平衡
稀释后的精液放入缓冲容器内，封口，进行降温平衡。
1.4.5 精液冷冻温度
初冻温度分别设置为（90±5）℃，冻精细管变成乳白色时全部浸入液氮中。
1.4.6 细管冻精解冻及质量检测
解冻后，在37℃环境下检查活力、顶体完整率和存活时间。
1.4.7 分析方法
采用SPSS软件进行统计分析，用LSD法多重比较各处理的差异性。
2 结果与分析
2.1 不同稀释液初选配方冷冻效果比较
3个稀释液配方A1， B1， C1中，B1解冻后活力最低，其次为Al， C1， Cl与Al比较，差异显著（P<0.05） ， B1与A1、C1比较，差异极显著（P<0.01） ;解冻后顶体完整率从高到低依次为C1、A1、B1，其中，C1、A1之间差异显著（P<0.05），B1与A1，C1比较，差异极显著（P<0.01）;解冻后38℃下存活时间，从长到短依次为C1、A1、B1，其中，C1、A1之间差异显著（P<0.05），B1与A1、C1比较，差异极显著（P<0.01）。据此，以C1配方为首选配方。
2.2 冻精稀释液配方第2次筛选
用等量的甘油替代乙二醇作为防冻剂，冷冻后精子活力A2>Al， B2>B1， C2>C1，并且A2>Al， B2>B1达到了显著水平（P<0.05） ，解冻后精子的解冻完整率A2>A1， B2>B1， C2>C1，并且均达到了显著水平（P<0.05），冻精解冻后在38℃下存活时间A2>A1， B2>B1， C2>C1，各比较组P>0.05，差异不显著。采用用等量的甘油替代乙二醇作为防冻剂可提高辽西驴细管冻精的综合质量。
2.3 优化稀释液配方中不同甘油浓度对冻精质量的影响
C23配方（甘油含量为5mL）时，冷冻后活力，冻后的顶体完整率、存活时间都比其它各组高，其中，C23的精子冷冻后活力较C21相比，差异极显著（P<0.01 ） ，与C22、C25相比较，差异达显著水平（P<0.05），与C24比较，差异不显著（P>0.05）;C23方的冻后顶体完整率，与C21、C22、C25相比较，差异显著（P<0.05 ），与24比较差异不显著（P>0.05）;精子解冻后在38℃下存活時间以C23组最高，C23与C21比较，差异达极显著水平（P<0.01），C23与C22、C25比较，差异达显著水平，C23与C24比较，差异不显著（P>0.05）。甘油的添加量以5mL最为适宜。
3 讨论与结论
（1）以甘油为冷冻剂的配方（葡萄糖1.2g、柠檬酸1.3g、Tris2.4g、甘油5mL、卵黄20mL、双蒸馏水100mL、青链霉素各1×105IU）可为制作辽西驴细管冷冻精液的首选配方。
（2）试验是以含有乙二醇或甘油为防冻剂的冻精稀释液采取一次性稀释精液的基础上进行的，没有进行精液二次稀释试验，而冻精稀释液最终配方为含有甘油防冻剂的稀释液，据相关报导，甘油对精子最有一定的毒性作用，而采取二次稀释法可以降低甘油对精子的毒副作用。与一次稀释相比，二次稀释可能使辽西驴细管冻精的冷冻效果进一步提升，因此，尚需开展二次稀释试验，以验证筛选出冻精稀释液配方的冷冻效果。
（3）试验是在3个初选配方的筛选后更换防冻剂的基础上进行，由于不同的稀释液的渗透压、pH值及对精细胞的保护作用都是不同的，因此，试验结论尚不能作为最终结论，还需进一步开展试验进行完善。
参考文献
[1] 杨莉，于杰，李海静，等.驴精液低温冷冻技术及应用进展[J].黑龙江畜牧兽医，2016（20）：80-81.
[2] 古丽海a，高斐.驴精液常温保存的研究[J].新疆畜牧业，2014 （11）：14-16.
[3] 王慧伟.驴精液保存技术研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.
基金项目：辽宁省中央引导地方科技发展专项-辽西驴品种种系发生、分子鉴定及保种研究（2019416032）
作者简介：武师良（1985-），男，农业推广硕士.畜牧师，研究方向：动物育种。
通信作者：刘兴伟（1965-） ，男，教授，研究员，畜牧师，研究方向：选育繁殖饲养。
关键词：辽西驴;冷冻精液;稀释液配方
中图分类号：S822 文献标识码：B
doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2019.21.008
0 引言
随着辽西驴饲养数量的增加，对辽西驴肉用品种进行种源选育、加强保种工作提上日程，为防止近交退化、杂交乱配造成的群体退化、生产性能下降，项目组于2019年6-8月开展辽西驴细管冷冻精液的制作研究，为提高辽西驴细管冻精的制作效果，在试验初期开展了辽西驴细管冷冻精液稀释液配方筛选试验，结果、结论如下。
1 材料与方法
1.1 精液来源
研究中使用的精液来源于建平县芮林牧业有限公司的4头种公驴。
1.2 试验药品
主要为分析纯无机盐、糖类、乙二醇、甘油[1]等试剂及抗菌素等。
1.3 试验器材
400～600倍光学显微镜[2]、离心机、恒温水浴锅、超低温温度仪、控温冰箱、电子天平、0.5 mL与0.25 mL细管[3]等。
1.4 试验方法
1.4.1 筛选冷冻稀释液
冷冻稀释液包括以乙二醇为防冻剂的初选配方;以等量甘油替代乙二醇为防冻剂的二次筛选配方;不同含量的防冻剂的优化配方。各配方具体成分如表1、表2、表3。
1.4.2 稀释溶液配制
原精离心液配制：蔗糖分析纯试剂110g，加蒸馏水1000mL煮沸至蔗糖全部溶解。
冷冻稀释液配制：准桷称量各配方中的基础试剂煮沸溶解制成溶液，常温冷却后加入抗菌素和卵黄，搅拌均匀。
1.4.3 精液离心与稀释2
原精经纱布（6～8层）过滤后，按1：1体积比例加入离心液，缓慢均匀混合后，装入离心管，在（30±4） ℃范围内以2000r/min离心10 min;离心后精液弃去上清液后在干净的容器内按1：1～1：2比例加入冷冻稀释液，等温缓慢混匀。
1.4.4 降温平衡
稀释后的精液放入缓冲容器内，封口，进行降温平衡。
1.4.5 精液冷冻温度
初冻温度分别设置为（90±5）℃，冻精细管变成乳白色时全部浸入液氮中。
1.4.6 细管冻精解冻及质量检测
解冻后，在37℃环境下检查活力、顶体完整率和存活时间。
1.4.7 分析方法
采用SPSS软件进行统计分析，用LSD法多重比较各处理的差异性。
2 结果与分析
2.1 不同稀释液初选配方冷冻效果比较
3个稀释液配方A1， B1， C1中，B1解冻后活力最低，其次为Al， C1， Cl与Al比较，差异显著（P<0.05） ， B1与A1、C1比较，差异极显著（P<0.01） ;解冻后顶体完整率从高到低依次为C1、A1、B1，其中，C1、A1之间差异显著（P<0.05），B1与A1，C1比较，差异极显著（P<0.01）;解冻后38℃下存活时间，从长到短依次为C1、A1、B1，其中，C1、A1之间差异显著（P<0.05），B1与A1、C1比较，差异极显著（P<0.01）。据此，以C1配方为首选配方。
2.2 冻精稀释液配方第2次筛选
用等量的甘油替代乙二醇作为防冻剂，冷冻后精子活力A2>Al， B2>B1， C2>C1，并且A2>Al， B2>B1达到了显著水平（P<0.05） ，解冻后精子的解冻完整率A2>A1， B2>B1， C2>C1，并且均达到了显著水平（P<0.05），冻精解冻后在38℃下存活时间A2>A1， B2>B1， C2>C1，各比较组P>0.05，差异不显著。采用用等量的甘油替代乙二醇作为防冻剂可提高辽西驴细管冻精的综合质量。
2.3 优化稀释液配方中不同甘油浓度对冻精质量的影响
C23配方（甘油含量为5mL）时，冷冻后活力，冻后的顶体完整率、存活时间都比其它各组高，其中，C23的精子冷冻后活力较C21相比，差异极显著（P<0.01 ） ，与C22、C25相比较，差异达显著水平（P<0.05），与C24比较，差异不显著（P>0.05）;C23方的冻后顶体完整率，与C21、C22、C25相比较，差异显著（P<0.05 ），与24比较差异不显著（P>0.05）;精子解冻后在38℃下存活時间以C23组最高，C23与C21比较，差异达极显著水平（P<0.01），C23与C22、C25比较，差异达显著水平，C23与C24比较，差异不显著（P>0.05）。甘油的添加量以5mL最为适宜。
3 讨论与结论
（1）以甘油为冷冻剂的配方（葡萄糖1.2g、柠檬酸1.3g、Tris2.4g、甘油5mL、卵黄20mL、双蒸馏水100mL、青链霉素各1×105IU）可为制作辽西驴细管冷冻精液的首选配方。
（2）试验是以含有乙二醇或甘油为防冻剂的冻精稀释液采取一次性稀释精液的基础上进行的，没有进行精液二次稀释试验，而冻精稀释液最终配方为含有甘油防冻剂的稀释液，据相关报导，甘油对精子最有一定的毒性作用，而采取二次稀释法可以降低甘油对精子的毒副作用。与一次稀释相比，二次稀释可能使辽西驴细管冻精的冷冻效果进一步提升，因此，尚需开展二次稀释试验，以验证筛选出冻精稀释液配方的冷冻效果。
（3）试验是在3个初选配方的筛选后更换防冻剂的基础上进行，由于不同的稀释液的渗透压、pH值及对精细胞的保护作用都是不同的，因此，试验结论尚不能作为最终结论，还需进一步开展试验进行完善。
参考文献
[1] 杨莉，于杰，李海静，等.驴精液低温冷冻技术及应用进展[J].黑龙江畜牧兽医，2016（20）：80-81.
[2] 古丽海a，高斐.驴精液常温保存的研究[J].新疆畜牧业，2014 （11）：14-16.
[3] 王慧伟.驴精液保存技术研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.
基金项目：辽宁省中央引导地方科技发展专项-辽西驴品种种系发生、分子鉴定及保种研究（2019416032）
作者简介：武师良（1985-），男，农业推广硕士.畜牧师，研究方向：动物育种。
通信作者：刘兴伟（1965-） ，男，教授，研究员，畜牧师，研究方向：选育繁殖饲养。