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摘要 目的：探討补阳还五汤（BYHWD）对脊髓损伤（SCI）大鼠的抗氧化作用及其机制。方法：将24只雄性SD大鼠随机分为对照组、SCI组、BYHWD低剂量（BL）组、BYHWD高剂量（BH）组，每组6只。采用游泳力竭法联合红核脊髓束（RST）横断手术制备SCI气虚血瘀证大鼠模型，对照组和SCI组予以生理盐水灌胃，其他组予以BYHWD灌胃，1次/d。通过自发性直立探究行为（前肢使用率）实验测试运动功能恢复情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，激光共聚焦观察环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子（CREB/BDNF）的表达。结果：干预后，BH组前肢和右前肢的利用率高于SCI组和BL组（P<0.05或P<0.01）;与SCI组比较，观察组的MDA水平均下降，SOD水平均上升，以BH组水平变化最为明显，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;激光共聚焦法显示，与SCI组比较，观察组CREB、BDNF的表达均上升，以BH组表达变化最为明显，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：补阳还五汤可改善SCI大鼠的抗氧化功能，其机制涉及CREB/BDNF信号通路的调节。
关键词 补阳还五汤;脊髓损伤;气虚血瘀证;氧化应激;神经营养因子;红核脊髓束;超氧化物歧化酶;丙二醛
Improve the Antioxidant Function and Action Mechanism of Spinal Cord Injury by Buyang Huanwu Decoction
FAN Tingting1，WAN Caiyun1，LU Qingqing1，JING Xiaoshuo1，ZHANG Wei2，FAN Yujie3，NIE Ying4，LI Liang1
（1 Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 2 College of Integrated Chinese and Western medicines，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 3 Department of Traditional Chinese Medicine，Hunan Brain Hospital，Changsha，Hunan 410007，China; 4 Department of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）
Abstract Objective：To explore the effects and the underlying mechanism of Buyang Huanwu Decoction（BYHWD） antioxidant function in spinal cord injury rats.Methods：A total of 24 male rats were randomly divided into the following 4 groups：a control group，a spinal cord injury model group（SCI group），a low-dose of BYHWD group（BL group），a high-dose of BYHWD group（BH group），with 6 rats in each group.The rat model was established by swimming exhaustion combined with the transection of rubrospinal tract（RST）.The rats in control group and SCI group were given normal saline by gavage once，and the other groups were given BYHWD by gavage once.The recovery of motor function was observed by spontaneous vertical exploration test.MDA and SOD in serum was detected by ELISA.laser scanning confocal microscopy was adapted to detect the expression of CREB and BDNF.Results：Compared with the SCI group，the utilization rates of both forelimbs and the right forelimb of the BH group were higher than those of the SCI group and the BL group（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the SCI group，ELISA showed that the expression of MDA were decreased in the treatment group，while the expression of SOD was increased，in which the BH group were most significant（P<0.05 or P<0.01）;Compared with the SCI group，Laser scanning confocal microscopy showed that the expression of CREB and BDNF were increased，in which the BH group were most significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：BYHWD could improve the antioxidant function through the CREB/BDNF pathway in spinal cord injury rats. Keywords Buyang Huanwu Decoction; Spinal cord injury; Qi-deficiency and blood-stasis syndrome; Antioxidation; Brain derived neurotrophic factor; Rubrospinal tract; Superoxide dismutase; Malondialdehyde
中图分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.008
脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是常见的神经系统损伤性疾病，常导致运动功能障碍，严重者可致瘫痪，以致殘率高，治愈率低为特点[1-4]。目前，SCI的治疗手段主要包括手术、激素类药物、物理疗法等，虽然能在一定程度上缓解该疾病的症状，但对神经功能恢复作用有限[5-6]。因此，有效治疗SCI仍是临床治疗和科学研究中的一个巨大挑战[7]。随着现代对中医药应用研究的大力开展，发现中医药治疗临床疾病具有途径丰富、靶点多样的特点，对治疗SCI有着独特而确切的优势[8]。补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BYHWD）在中医学理论中为益气活血法的代表方，可治疗偏瘫、疲乏、萎软等症状。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response Element Binding Protein，CREB）是环磷酸腺苷（Cyclic Adenosinemonophosphate，cAMP）转录调控因子，其活化后可调控脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）的转录与表达。CREB/BDNF信号通路的激活在保护神经元、促进突触再生等神经修复方面发挥着重要作用[9-10]。有研究表明，在脑血管疾病中，机体抗氧化功能和CREB/BDNF信号通路的激活有关[11]，并且目前对BYHWD改善脊髓损伤的抗氧化功能及其机制的研究较少，因此，本实验在建立SCI气虚血瘀证大鼠模型后，采用行为学检测大鼠肢体运动功能状况、酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性作为抗氧化功能的指标，激光共聚焦技术检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子（CREB/BDNF）的表达，共同研究CREB/BDNF信号通路在BYHWD改善SCI抗氧化功能中的作用及其机制，为该疾病的临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 购买Sprague-Dawley成年健康雄性大鼠24只，无特定病原体（SPF）级，体质量200～220 g，由湖南中医药大学实验动物中心代购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号：SCXK（湘）2019-0004，伦理编号：LL2021030503）。在卫生清洁、温度22～25 ℃和相对湿度为50%～70%的饲养环境中分笼喂养，适应性喂养1周后进行造模给药干预，每日按时等量供给高温高压灭菌饲料和水。
1.1.2 药物 BYHWD处方：黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g。BYHWD处方中药饮片购于老百姓大药房连锁股份有限公司，且严格遵循《中华人民共和国药典》2015年版一部要求。将药物饮片用电子秤精确称量，加每份处方药物重量的10倍量水浸泡0.5 h，煮至沸腾后加热并保持沸腾0.5 h。纱布过滤煎液，再将煎液用滤纸抽滤得滤液。向所剩药渣继续加入8倍量水，重复上述操作再得滤液。合并2次滤液至不锈钢锅中，放入旋转蒸发仪浓缩。待膏剂欲形成时迅速取出，称重，浓缩至生药浓度为2 g/mL的膏剂，放置于4 ℃冰箱保存备用。
1.3 试剂与仪器 苯巴比妥钠注射液（哈药集团三精制药有限公司，批号：H23021167），大鼠MDA ELISA试剂盒（上海樊克生物科技有限公司，批号：FK-S1922），大鼠SOD ELISA试剂盒（上海樊克生物科技有限公司，批号：FK-S1921），Anti-CREB Antibody（Sigma公司，美国，批号：MAB5432），Anti-BDNF antibody（Sigma公司，美国，批号：HPA056104）、山羊抗兔IgG-FITC（Santa Cruz公司，美国，批号：sc-2777），山羊抗小鼠IgG-TRITC（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZF-0313），山羊超敏二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K166918D），酶标仪（Sunrise公司，瑞士，型号：F50），激光共聚焦显微镜（ZEISS公司，德国，型号：LSM710）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将24只大鼠随机分为对照组、SCI组、BYHWD低剂量（BL）组、BYHWD高剂量（BH）组、每组6只。除对照组外其余3组均采用“游泳力竭法联合RST横断术”进行大鼠气虚血瘀证模型制备[12]：将大鼠放入水温22～25 ℃，深度40 cm且无逃生平台的玻璃圆柱桶内进行游泳直到力竭，1次/d，1 h/次，持续21 d，建立“气虚”状态。经过21 d的强迫游泳后，注射苯巴比妥钠对大鼠进行麻醉，固定于鼠台，在手术显微镜下逐层分离大鼠颈背部肌肉组织，暴露C3、C4之间颈脊髓，横断右侧红核脊髓束（Rubrospinal Tract，RST），建立局部“血瘀”状态。
1.2.2 给药方法 BL组以BYHWD 10 g/kg灌胃，BH组以BYHWD 40 g/kg灌胃，对照组和SCI组均以等量生理盐水灌胃，1次/d，持续干预28 d后处死所有动物。 1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 肢体行为学检测 以RST横断术后0 d、术后1 d、14 d、28 d为时间点观察大鼠前肢功能恢复情况，进行自发性直立探究行为（前肢使用率）测试。将每只大鼠放入高40 cm的透明玻璃缸内，大鼠可自发竖起前肢攀沿玻璃缸壁进行探究活动。记录大鼠在5 min内使用双侧前肢触碰缸壁进行探究行为的次数（N）、单独使用右前肢触碰缸壁进行探究行为的次数（n），计算总次数（N+n）。则双侧前肢、单侧右前肢的使用率分别为N/（N+n）和n/（N+n）。
1.2.3.4 酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测血清中MDA、SOD的表达 采集在清晨空腹状态下的大鼠的静脉全血2 mL，室温静置1 h后在4 ℃温度下以1 200×g持续离心15 min，留上层血清样本用于檢测，遵循大鼠MDA ELISA试剂盒与大鼠SOD ELISA试剂盒说明书进行实验，在酶标包被板上的样品孔中依次加入样品稀释液40 μL、待测样品10 μL，将待测样品稀释5倍;封板膜封板后置于37 ℃温育30 min，洗涤，在各反应孔中，加新鲜稀释的酶标抗体50 μL继续温育30 min，洗涤，加底物液50 μL显色，避光反应15 min，加入终止液25 μL，在450 nm波长下读取光密度（OD）值，根据标准曲线计算MDA SOD的实际表达量。
1.2.3.5 激光共聚焦技术检测红核神经元中CREB、BDNF的表达 取固定后的大鼠脑组织样本，分别进行连续冰冻切片，保证每片厚度为5 μm，依次裱贴于黏附载玻片上，切片入PBS洗涤2遍，经4%多聚甲醛溶液固定30 min，用0.25% TritonX-100和5% BSA透膜封闭切片2 h，PBS洗涤2遍，滴加CREB抗体稀释液（1∶100）与BDNF抗体稀释液（1∶100），4 ℃冰箱内过夜，然后将切片在PBS中洗涤并分别与TRITC缀合的鼠抗IgG（1∶200）和FITC缀合的兔抗IgG（1∶200）孵育，在37 ℃的黑暗潮湿容器中放置1 h，PBS洗涤，二脒基苯基吲哚（DAPI）染核并封片，在激光共聚焦显微镜400倍下分别观察红色TRITC标记（细胞核及细胞质）的CREB和绿色FITC标记（细胞质）的BDNF，计算平均光密度。
1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件对研究数据进行统计分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示。满足正态性和方差齐性的数据，多组间比较采用单因素方差分析;不满足正态性的资料采用Kruskal-Wallis，不符合方差齐性的资料则采用Dunnett′sT3法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物一般情况 SCI组、BL组与BH组大鼠在连续游泳后出现鼻尖难以透出水面，捞出后呈疲惫状，目闭身摇，步履蹒跚，一触即倒;手术造模后的大鼠苏醒后出现右侧前爪无法张开，呈屈曲状态紧贴躯干。在游泳联合手术造模以及给药干预过程中均无大鼠死亡。
2.2 各组自发性直立试验结果比较 在术后0 d，4组大鼠双侧前肢和单侧右前肢利用率为40%～55%，差异均无统计学意义（均P>0.05）。在强迫游泳结束行RST横断术后1 d，与正常组大鼠比较，其余3组的双侧前肢和单侧右前肢利用率均为0，差异均有统计学意义（均P<0.01）;术后第14天和第28天，BL和BH组的双侧前肢和单侧右前肢利用率均高于SCI组，差异均有统计学意义（均P<0.01）;术后第28天，BH组的双侧前肢和单侧右前肢利用率高于BL组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
2.3 各组血清MDA、SOD水平比较 与正常组比较，SCI组、BL组与BH组的大鼠血清中MDA水平明显上升，SOD水平下降，差异均有统计学意义（均P<0.01或P<0.05）。其中SCI组MDA水平最高，SOD水平最低;与SCI组比较，BL组与BH组的大鼠血清MDA水平下降，SOD水平上升，差异均有统计学意义（均P<0.01）;与BL组比较，BH组大鼠血清中MDA水平下降，SOD水平上升，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图2。
2.4 激光共聚焦技术检测CREB、BDNF在中脑红核区的表达 激光共聚焦结果各组大鼠中脑红核区均有CREB和BDNF阳性表达，其中红色荧光为CREB的阳性表达，绿色荧光为BDNF的阳性表达，蓝色荧光为二脒基苯基吲哚（DAPI）染核表达，图像合并后，绿色与红色荧光重合部分，表明CREB与BDNF共定位。与对照组比较，SCI组、BL组中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞数目显著减少，BH组中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞减少程度较轻，差异有统计学意义（P<0.01）;与SCI组比较，BL组与BH组大鼠中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞数目显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与BL组比较，BH组大鼠中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞数目显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3、图4。
3 讨论
脊髓与中医学理论中的督脉异名而同类，SCI后多表现出偏瘫、神经反射异常、疼痛、疲乏、口角流涎等症状。中医学者大多认为其病机与督脉受损，淤血留滞，阻滞气机，气血运行不畅加之久卧伤气相关，多归属于气虚血瘀证[13]。因此，根据中医学中“劳则气耗”的理论，采用“游泳力竭法”，连续21 d强迫大鼠游泳直到筋疲力竭，制备大鼠“气虚”状态模型[14]。在此基础上，行RST横断术建立SCI局部血瘀状态，RST起源于中脑的红核，可以调节大鼠前肢的精细运动功能，因此RST受损时，出现运动功能障碍的可能性较大，且RST大部分纤维下行于对侧脊髓，因此在不损伤对侧脊髓的前提下选择RST一侧横断，简单易行[15-16]。RST横断术不会造成椎弓板损伤，造成的创伤和出血也较少，优于传统造模方式。因此采用游泳力竭法联合RST横断术制备大鼠SCI气虚血瘀证模型是可行的。 BYHWD在現代医疗中多应用于心脑血管和神经系统疾病的治疗。研究表明，BYHWD能明显改善SCI大鼠肢体运动功能，修复SCI，可能与其改善微循环、改善轴浆运输能力、拮抗神经元凋亡、抑制神经轴突生长抑制因子、促进神经细胞及神经纤维生长等因素有关[17-20]。因此，本研究在BL组、BH组大鼠手术造模后给予不同剂量的补阳还五汤，观察补阳还五汤对SCI大鼠运动功能的恢复效果，并探讨其可能的作用机制。除对照组外，其余组在连续21 d的强迫游泳后，均出现目闭身摇，疲软无力的症状，说明游泳力竭法可致气虚。在行为学测试中，在RST术后第1天，与对照组比较，SCI组、BL和BH组在RST横断术后，前肢双侧及单侧利用率均为0，大鼠身懒喜静，说明造模后，严重损伤大鼠前肢运动功能，造模成功。第14天和第28天，与SCI组比较，BL和BH组的前肢利用率均高于SCI组，气虚症状减轻，精神状态良好，且第28天，BH组的前肢利用率均高于BL组，气虚症状明显减轻，精神状态明显好转，说明BYHWD对改善SCI后前肢运动功能有明显作用，且BH组疗效优于BL组，提示恢复时间相同，疗效可能与剂量成正比。且与第14天比较，第28天时，BL组与BH组大鼠前肢利用率均明显上升，精神状态恢复良好，提示在相同剂量条件下，疗效可能与治疗时间成正比。因此，补阳还五汤治疗对SCI后运动功能恢复效果显著，加快康复速度。
BYHWD具有显著的抗氧化作用，在SCI后，神经元缺血缺氧状态下将会产生和释放大量氧自由基，这些产物可破坏细胞膜，造成细胞损伤从而影响神经细胞的功能[21-23]。因此，抑制自由基产生和清除自由基有利于SCI早期治疗。研究发现，MDA可反映自由基水平，是组织细胞损伤的重要标志。而SOD为氧自由基清除剂，代表机体清除氧自由基的能力[24]。测定MDA、SOD可显示体内自由基的水平，是反映机体抗氧化功能的重要标志[25]。CREB是受多种因素调节靶基因转录的转录因子，其活化后在BDNF的转录调节及信号通路激活中发挥重要作用[26，27]。BDNF主要表达于中枢神经系统，在调控细胞凋亡、促进突触再生和营养神经细胞等方面发挥重要作用[28-30]。研究表明，SCI后神经元轴突受损，轴突损伤可能导致轴突运输能力减弱或消失，进而导致神经元胞体萎缩或死亡，神经元胞体死亡可导致BDNF缺乏，削弱脊髓修复能力[31]。且脑血管疾病临床实验研究证明，氧化应激反应可降低BDNF水平，BDNF水平降低则削弱对氧化应激反应的抑制作用[32-33]。而SCI后，氧化应激与CREB/BDNF信号通路的关系尚无相关研究报道。因此，本实验采用ELISA测定MDA、SOD变化情况反映BYHWD治疗SCI的抗氧化功能变化;采用激光共聚焦技术测定CREB、BDNF在红核神经元中表达水平及定位。共同说明BYHWD治疗SCI过程中，抗氧化作用与CREB/BDNF信号通路的关系。ELISA和激光共聚焦检测结果表明，与对照组比较，SCI组的大鼠血清中MDA水平上升，SOD水平下降，说明SCI造模后的大鼠氧化应激状态明显，抗氧化能力受损严重。且氧化应激状态下，中脑红核区内CREB、BDNF表达水平降低，说明氧化应激抑制CREB/BDNF信号通路，损害红核神经元功能。与SCI组比较，BL组与BH组的大鼠血清MDA水平下降，SOD水平上升，同时中脑红核区内CREB、BDNF表达水平也增加，说明BYHWD干预可削弱氧化应激的影响，抑制和清除氧自由基，激活CREB/BDNF信号通路，提高SCI后大鼠机体的抗氧化能力，而抗氧化能力增强对CREB/BDNF信号通路亦有促进作用，二者相互影响，促进修复神经元功能。与BL组比较，BH组大鼠血清中MDA水平下降，SOD水平上升，脑红核区内CREB、BDNF水平上升明显，说明BYHWD对SCI的抗氧化功能以及抗氧化能力对CREB/BDNF信号通路促进作用可能与BYHWD剂量正相关。实验中各指标测试结果与大鼠行为学测试结果一致，也佐证了本实验研究的假设，说明BYHWD干预对SCI发挥抗氧化作用，激活CREB/BDNF信号通路，促进SCI修复。
综上所述，BYHWD可改善SCI后氧化应激状态，增强机体抗氧化功能，且抗氧化功能与CREB/BDNF信号通路的调节密切相关，二者相辅相成，改善SCI大鼠运动功能，促进SCI修复，且呈剂量依赖性，为临床诊疗提供新的思路。但是BYHWD治疗SCI的最佳剂量范围、周期以及何种化合物在抗氧化功效中发挥重要作用等方面还有待进一步的实验探索[34]。
参考文献
[1]Anwar MA，Al Shehabi TS，Eid AH.Inflammogenesis of secondary spinal cord injury[J].Front Cell Neurosci，2016，10：98.
[2]do Vale Ramos RC，Alegrete N.The role of pharmacotherapy in modifying the neurological status of patients with spinal and spinal cord injuries[J].Rev Bras Ortop，2015，50（6）：617-24.
[3]Jain NB，Ayers GD，Peterson EN，et al.Traumaticspinalcordinjury in the UnitedStates，1993-2012[J].JAMA，2015，313（22）：2236-2243.
[4]Ma L，Mu Y，Zhang Z，et al.Eugenol promotes functional recovery and alleviates inflammation，oxidative stress，and neural apoptosis in a rat model of spinal cord injury[J].Restor Neurol Neurosci，2018，36（5）：659-668. [5]Ahuja CS，Martin AR，Fehlings M.Recent advances in managing a spinal cord injury secondary to trauma[J].F1000Res，2016，5：F1000 Faculty Rev-1017.
[6]Cerqueira SR，Oliveira JM，Silva NA，et al.Microglia response and in vivo therapeutic potential of methylprednisolone-loaded dendrimer nanoparticles in spinal cord injury[J].Small，2016，12（8）：972.
[7]Cong Y，Wang C，Wang J，et al.NT-3 promotes oligodendrocyte proliferation and nerve function recovery after spinal cord injury by inhibiting autophagy pathway[J].J Surg Res，2020，247：128-135.
[8]孫忠人，徐思禹，田洪昭，等.中药及有效成分治疗脊髓损伤的研究概况[J].中华中医药杂志，2020，35（6）：3003-3006.
[9]Motaghinejad M，Motevalian M，Fatima S，et al.The neuroprotective effect of curcumin against nicotine-induced neurotoxicity is mediated by CREB-BDNF signaling pathway[J].Neurochem Res，2017，42（10）：2921-2932.
[10]Feng H，Wang C，He W，et al.Roflumilast ameliorates cognitive impairment in APP/PS1 mice via cAMP/CREB/BDNF signaling and anti-neuroinflammatory effects[J].Metab Brain Dis，2019，34（2）：583-591.
[11]Chen F，Zhou CC，Yang Y，et al.GM1 ameliorates lead-induced cognitive deficits and brain damage through activating the SIRT1/CREB/BDNF pathway in the developing male rat hippocampus[J].Biol Trace Elem Res，2019，190（2）：425-436.
[12]吴万丰，聂慧芳，胡立娟，等.补阳还五汤对缺血性脑卒中气虚血瘀证大鼠肠道菌群及其血浆代谢产物的影响[J].中草药，2021，52（1）：118-128.
[13]Xian-Hui D，Xiao-Ping H，Wei-Juan G.Neuroprotective effects of the Buyang Huanwu decoction on functional recovery in rats following spinal cord injury[J].J Spinal Cord Med，2016，39（1）：85-92.
[14]Hu WJ，Zhang BT，Wu R.Comparison of bulbar conjunctival microcirculation in rabbits of five subtypes of blood stasis syndrome[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2013，33（9）：1261-1266.
[15]Liang H，Paxinos G，Watson C.The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse[J].Brain Struct Funct，2012，217（2）：221-232.
[16]García-Alías G，Truong K，Shah PK，et al.Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries[J].Exp Neurol，2015，266：112-119.
[17]齐英娜，谭明生，王延雷，等.补阳还五汤对大鼠急性上颈脊髓损伤后血小板活化因子的影响[J].中国骨伤，2018，31（2）：170-174.
[18]周彬，范瑜洁，聂颖，等.补阳还五汤联合BMSCs移植对脊髓损伤气虚血瘀证红核神经元的影响[J].湖南中医药大学学报，2019，39（5）：568-572.
[19]王宏江，段晓娜，王鹏，等.游泳训练联合补阳还五汤对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生抑制因子的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2017，39（3）：222-225.
[20]Guo ZP，Huang MN，Liu AQ，et al.Buyang Huanwu decoction up-regulates Notch1 gene expression in injured spinal cord[J].Neural Regen Res，2015，10（8）：1321-133. [21]邵乐，夏相宜，王宇红，等.补阳还五汤精简方对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用研究[J].湖南中医药大学学报，2019，39（2）：163-167.
[22]孙忠人，徐思禹，李全，等.近5年中药治疗脊髓损伤相关机制研究进展[J].中国中医药信息杂志，2019，26（11）：132-135.
[23]肖玉焕，韩丽，李浩然，等.灵芝多糖防治中枢神经系统疾病的研究进展[J].中草药，2020，51（24）：6391-6395.
[24]Peng Y，Wang Y，Li J，et al.Utility of NSE，ProGRP and LDH in diagnosis and treatment in patients with small cell lung cancer[J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2016，19（9）：590-594.
[25]Sarkar C，Jones JW，Hegdekar N，et al.PLA2G4A/cPLA2-mediated lysosomal membrane damage leads to inhibition of autophagy and neurodegeneration after brain trauma[J].Autophagy，2020，16（3）：466-485.
[26]向芃，谢可炜，姜金星，等.蛋白激酶A部分通过环磷腺苷效应元件结合蛋白信号防止足细胞凋亡[J].上海交通大学学报：医学版，2016，36（1）：6-12.
[27]Tao H，Li X，Wei K，et al.Cyclic AMP prevents decrease of phosphorylated ezrin/radixin/moesin and chloride intracellular channel 5 expressions in injured podocytes[J].Clin Exp Nephrol，2015，19（6）：1000-1006.
[28]Khan IU，Yoon Y，Kim A，et al.Improved healing after the co-transplantation of HO-1 and BDNF overexpressed mesenchymal stem cells in the subacute spinal cord injury of dogs[J].Cell Transplant，2018，27（7）：1140-1153.
[29]Liu B，Li LL，Tan XD，et al.Gadd45b mediates axonal plasticity and subsequent functional recovery after experimental stroke in rats[J].Mol Neurobiol，2015，52（3）：1245-1256.
[30]Wang Y，Li W，Wang M，et al.Quercetin reduces neural tissue damage and promotes astrocyte activation after spinal cord injury in rats[J].J Cell Biochem，2018，119（2）：2298-2306.
[31]曾歡欢，黄英如，李子健，等.大黄素对大鼠急性脊髓损伤后氧化应激和炎症反应的影响研究[J].中国中药杂志，2018，43（9）：1886-1893.
[32]Jing L，Wang JG，Zhang JZ，et al.Upregulation of ICAM-1 in diabetic rats after transient forebrain ischemia and reperfusion injury[J].J Inflamm（Lond），2014，11（1）：35.
[33]Abe Y，Honsho M，Kawaguchi R，et al.A peroxisome deficiency-induced reductive cytosol state up-regulates the brain-derived neurotrophic factor pathway[J].J Biol Chem，2020，295（16）：5321-5334.
[34]刘建春，张红珍，郭文娟，等.补阳还五汤对自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠神经保护作用的机制探讨[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（14）：55-61.
（2020-11-25收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（81302899）——基于cAMP/PKA/RhoA信号通路探讨益气活血法促进BMSCs移植修复脊髓损伤的机制;湖南省自然科学基金项目（2018JJ2289）——补阳还五汤介导钙超载修复脊髓损伤的机制研究;湖南省自然科学基金项目（2019JJ80071）——基于红核蛋白质组学探讨益气活血法修复脊髓损伤的分子机制;湖南省自然科学基金项目（2019JJ50310）——基于mTOR通路探讨益气活血法对脊髓损伤大鼠红核自噬的调节机制;湖南中医药大学中医学一流学科开放基金项目（2018ZYX01）——基于线粒体能量代谢异常探讨益气活血法挽救脊髓损伤凋亡细胞的机制
作者简介：范婷婷（1994.06—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医药修复中枢神经系统损伤，E-mail：[email protected]
通信作者：李亮（1980.02—），男，博士，副教授，研究方向：中医药修复中枢神经系统损伤，中医情志病基础研究，E-mail：[email protected]
关键词 补阳还五汤;脊髓损伤;气虚血瘀证;氧化应激;神经营养因子;红核脊髓束;超氧化物歧化酶;丙二醛
Improve the Antioxidant Function and Action Mechanism of Spinal Cord Injury by Buyang Huanwu Decoction
FAN Tingting1，WAN Caiyun1，LU Qingqing1，JING Xiaoshuo1，ZHANG Wei2，FAN Yujie3，NIE Ying4，LI Liang1
（1 Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 2 College of Integrated Chinese and Western medicines，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China; 3 Department of Traditional Chinese Medicine，Hunan Brain Hospital，Changsha，Hunan 410007，China; 4 Department of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）
Abstract Objective：To explore the effects and the underlying mechanism of Buyang Huanwu Decoction（BYHWD） antioxidant function in spinal cord injury rats.Methods：A total of 24 male rats were randomly divided into the following 4 groups：a control group，a spinal cord injury model group（SCI group），a low-dose of BYHWD group（BL group），a high-dose of BYHWD group（BH group），with 6 rats in each group.The rat model was established by swimming exhaustion combined with the transection of rubrospinal tract（RST）.The rats in control group and SCI group were given normal saline by gavage once，and the other groups were given BYHWD by gavage once.The recovery of motor function was observed by spontaneous vertical exploration test.MDA and SOD in serum was detected by ELISA.laser scanning confocal microscopy was adapted to detect the expression of CREB and BDNF.Results：Compared with the SCI group，the utilization rates of both forelimbs and the right forelimb of the BH group were higher than those of the SCI group and the BL group（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the SCI group，ELISA showed that the expression of MDA were decreased in the treatment group，while the expression of SOD was increased，in which the BH group were most significant（P<0.05 or P<0.01）;Compared with the SCI group，Laser scanning confocal microscopy showed that the expression of CREB and BDNF were increased，in which the BH group were most significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：BYHWD could improve the antioxidant function through the CREB/BDNF pathway in spinal cord injury rats. Keywords Buyang Huanwu Decoction; Spinal cord injury; Qi-deficiency and blood-stasis syndrome; Antioxidation; Brain derived neurotrophic factor; Rubrospinal tract; Superoxide dismutase; Malondialdehyde
中图分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.008
脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是常见的神经系统损伤性疾病，常导致运动功能障碍，严重者可致瘫痪，以致殘率高，治愈率低为特点[1-4]。目前，SCI的治疗手段主要包括手术、激素类药物、物理疗法等，虽然能在一定程度上缓解该疾病的症状，但对神经功能恢复作用有限[5-6]。因此，有效治疗SCI仍是临床治疗和科学研究中的一个巨大挑战[7]。随着现代对中医药应用研究的大力开展，发现中医药治疗临床疾病具有途径丰富、靶点多样的特点，对治疗SCI有着独特而确切的优势[8]。补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BYHWD）在中医学理论中为益气活血法的代表方，可治疗偏瘫、疲乏、萎软等症状。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response Element Binding Protein，CREB）是环磷酸腺苷（Cyclic Adenosinemonophosphate，cAMP）转录调控因子，其活化后可调控脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）的转录与表达。CREB/BDNF信号通路的激活在保护神经元、促进突触再生等神经修复方面发挥着重要作用[9-10]。有研究表明，在脑血管疾病中，机体抗氧化功能和CREB/BDNF信号通路的激活有关[11]，并且目前对BYHWD改善脊髓损伤的抗氧化功能及其机制的研究较少，因此，本实验在建立SCI气虚血瘀证大鼠模型后，采用行为学检测大鼠肢体运动功能状况、酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性作为抗氧化功能的指标，激光共聚焦技术检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子（CREB/BDNF）的表达，共同研究CREB/BDNF信号通路在BYHWD改善SCI抗氧化功能中的作用及其机制，为该疾病的临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 购买Sprague-Dawley成年健康雄性大鼠24只，无特定病原体（SPF）级，体质量200～220 g，由湖南中医药大学实验动物中心代购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号：SCXK（湘）2019-0004，伦理编号：LL2021030503）。在卫生清洁、温度22～25 ℃和相对湿度为50%～70%的饲养环境中分笼喂养，适应性喂养1周后进行造模给药干预，每日按时等量供给高温高压灭菌饲料和水。
1.1.2 药物 BYHWD处方：黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g。BYHWD处方中药饮片购于老百姓大药房连锁股份有限公司，且严格遵循《中华人民共和国药典》2015年版一部要求。将药物饮片用电子秤精确称量，加每份处方药物重量的10倍量水浸泡0.5 h，煮至沸腾后加热并保持沸腾0.5 h。纱布过滤煎液，再将煎液用滤纸抽滤得滤液。向所剩药渣继续加入8倍量水，重复上述操作再得滤液。合并2次滤液至不锈钢锅中，放入旋转蒸发仪浓缩。待膏剂欲形成时迅速取出，称重，浓缩至生药浓度为2 g/mL的膏剂，放置于4 ℃冰箱保存备用。
1.3 试剂与仪器 苯巴比妥钠注射液（哈药集团三精制药有限公司，批号：H23021167），大鼠MDA ELISA试剂盒（上海樊克生物科技有限公司，批号：FK-S1922），大鼠SOD ELISA试剂盒（上海樊克生物科技有限公司，批号：FK-S1921），Anti-CREB Antibody（Sigma公司，美国，批号：MAB5432），Anti-BDNF antibody（Sigma公司，美国，批号：HPA056104）、山羊抗兔IgG-FITC（Santa Cruz公司，美国，批号：sc-2777），山羊抗小鼠IgG-TRITC（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZF-0313），山羊超敏二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K166918D），酶标仪（Sunrise公司，瑞士，型号：F50），激光共聚焦显微镜（ZEISS公司，德国，型号：LSM710）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 将24只大鼠随机分为对照组、SCI组、BYHWD低剂量（BL）组、BYHWD高剂量（BH）组、每组6只。除对照组外其余3组均采用“游泳力竭法联合RST横断术”进行大鼠气虚血瘀证模型制备[12]：将大鼠放入水温22～25 ℃，深度40 cm且无逃生平台的玻璃圆柱桶内进行游泳直到力竭，1次/d，1 h/次，持续21 d，建立“气虚”状态。经过21 d的强迫游泳后，注射苯巴比妥钠对大鼠进行麻醉，固定于鼠台，在手术显微镜下逐层分离大鼠颈背部肌肉组织，暴露C3、C4之间颈脊髓，横断右侧红核脊髓束（Rubrospinal Tract，RST），建立局部“血瘀”状态。
1.2.2 给药方法 BL组以BYHWD 10 g/kg灌胃，BH组以BYHWD 40 g/kg灌胃，对照组和SCI组均以等量生理盐水灌胃，1次/d，持续干预28 d后处死所有动物。 1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 肢体行为学检测 以RST横断术后0 d、术后1 d、14 d、28 d为时间点观察大鼠前肢功能恢复情况，进行自发性直立探究行为（前肢使用率）测试。将每只大鼠放入高40 cm的透明玻璃缸内，大鼠可自发竖起前肢攀沿玻璃缸壁进行探究活动。记录大鼠在5 min内使用双侧前肢触碰缸壁进行探究行为的次数（N）、单独使用右前肢触碰缸壁进行探究行为的次数（n），计算总次数（N+n）。则双侧前肢、单侧右前肢的使用率分别为N/（N+n）和n/（N+n）。
1.2.3.4 酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测血清中MDA、SOD的表达 采集在清晨空腹状态下的大鼠的静脉全血2 mL，室温静置1 h后在4 ℃温度下以1 200×g持续离心15 min，留上层血清样本用于檢测，遵循大鼠MDA ELISA试剂盒与大鼠SOD ELISA试剂盒说明书进行实验，在酶标包被板上的样品孔中依次加入样品稀释液40 μL、待测样品10 μL，将待测样品稀释5倍;封板膜封板后置于37 ℃温育30 min，洗涤，在各反应孔中，加新鲜稀释的酶标抗体50 μL继续温育30 min，洗涤，加底物液50 μL显色，避光反应15 min，加入终止液25 μL，在450 nm波长下读取光密度（OD）值，根据标准曲线计算MDA SOD的实际表达量。
1.2.3.5 激光共聚焦技术检测红核神经元中CREB、BDNF的表达 取固定后的大鼠脑组织样本，分别进行连续冰冻切片，保证每片厚度为5 μm，依次裱贴于黏附载玻片上，切片入PBS洗涤2遍，经4%多聚甲醛溶液固定30 min，用0.25% TritonX-100和5% BSA透膜封闭切片2 h，PBS洗涤2遍，滴加CREB抗体稀释液（1∶100）与BDNF抗体稀释液（1∶100），4 ℃冰箱内过夜，然后将切片在PBS中洗涤并分别与TRITC缀合的鼠抗IgG（1∶200）和FITC缀合的兔抗IgG（1∶200）孵育，在37 ℃的黑暗潮湿容器中放置1 h，PBS洗涤，二脒基苯基吲哚（DAPI）染核并封片，在激光共聚焦显微镜400倍下分别观察红色TRITC标记（细胞核及细胞质）的CREB和绿色FITC标记（细胞质）的BDNF，计算平均光密度。
1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件对研究数据进行统计分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示。满足正态性和方差齐性的数据，多组间比较采用单因素方差分析;不满足正态性的资料采用Kruskal-Wallis，不符合方差齐性的资料则采用Dunnett′sT3法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物一般情况 SCI组、BL组与BH组大鼠在连续游泳后出现鼻尖难以透出水面，捞出后呈疲惫状，目闭身摇，步履蹒跚，一触即倒;手术造模后的大鼠苏醒后出现右侧前爪无法张开，呈屈曲状态紧贴躯干。在游泳联合手术造模以及给药干预过程中均无大鼠死亡。
2.2 各组自发性直立试验结果比较 在术后0 d，4组大鼠双侧前肢和单侧右前肢利用率为40%～55%，差异均无统计学意义（均P>0.05）。在强迫游泳结束行RST横断术后1 d，与正常组大鼠比较，其余3组的双侧前肢和单侧右前肢利用率均为0，差异均有统计学意义（均P<0.01）;术后第14天和第28天，BL和BH组的双侧前肢和单侧右前肢利用率均高于SCI组，差异均有统计学意义（均P<0.01）;术后第28天，BH组的双侧前肢和单侧右前肢利用率高于BL组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。
2.3 各组血清MDA、SOD水平比较 与正常组比较，SCI组、BL组与BH组的大鼠血清中MDA水平明显上升，SOD水平下降，差异均有统计学意义（均P<0.01或P<0.05）。其中SCI组MDA水平最高，SOD水平最低;与SCI组比较，BL组与BH组的大鼠血清MDA水平下降，SOD水平上升，差异均有统计学意义（均P<0.01）;与BL组比较，BH组大鼠血清中MDA水平下降，SOD水平上升，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见图2。
2.4 激光共聚焦技术检测CREB、BDNF在中脑红核区的表达 激光共聚焦结果各组大鼠中脑红核区均有CREB和BDNF阳性表达，其中红色荧光为CREB的阳性表达，绿色荧光为BDNF的阳性表达，蓝色荧光为二脒基苯基吲哚（DAPI）染核表达，图像合并后，绿色与红色荧光重合部分，表明CREB与BDNF共定位。与对照组比较，SCI组、BL组中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞数目显著减少，BH组中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞减少程度较轻，差异有统计学意义（P<0.01）;与SCI组比较，BL组与BH组大鼠中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞数目显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与BL组比较，BH组大鼠中脑红核区内CREB、BDNF阳性染色细胞数目显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3、图4。
3 讨论
脊髓与中医学理论中的督脉异名而同类，SCI后多表现出偏瘫、神经反射异常、疼痛、疲乏、口角流涎等症状。中医学者大多认为其病机与督脉受损，淤血留滞，阻滞气机，气血运行不畅加之久卧伤气相关，多归属于气虚血瘀证[13]。因此，根据中医学中“劳则气耗”的理论，采用“游泳力竭法”，连续21 d强迫大鼠游泳直到筋疲力竭，制备大鼠“气虚”状态模型[14]。在此基础上，行RST横断术建立SCI局部血瘀状态，RST起源于中脑的红核，可以调节大鼠前肢的精细运动功能，因此RST受损时，出现运动功能障碍的可能性较大，且RST大部分纤维下行于对侧脊髓，因此在不损伤对侧脊髓的前提下选择RST一侧横断，简单易行[15-16]。RST横断术不会造成椎弓板损伤，造成的创伤和出血也较少，优于传统造模方式。因此采用游泳力竭法联合RST横断术制备大鼠SCI气虚血瘀证模型是可行的。 BYHWD在現代医疗中多应用于心脑血管和神经系统疾病的治疗。研究表明，BYHWD能明显改善SCI大鼠肢体运动功能，修复SCI，可能与其改善微循环、改善轴浆运输能力、拮抗神经元凋亡、抑制神经轴突生长抑制因子、促进神经细胞及神经纤维生长等因素有关[17-20]。因此，本研究在BL组、BH组大鼠手术造模后给予不同剂量的补阳还五汤，观察补阳还五汤对SCI大鼠运动功能的恢复效果，并探讨其可能的作用机制。除对照组外，其余组在连续21 d的强迫游泳后，均出现目闭身摇，疲软无力的症状，说明游泳力竭法可致气虚。在行为学测试中，在RST术后第1天，与对照组比较，SCI组、BL和BH组在RST横断术后，前肢双侧及单侧利用率均为0，大鼠身懒喜静，说明造模后，严重损伤大鼠前肢运动功能，造模成功。第14天和第28天，与SCI组比较，BL和BH组的前肢利用率均高于SCI组，气虚症状减轻，精神状态良好，且第28天，BH组的前肢利用率均高于BL组，气虚症状明显减轻，精神状态明显好转，说明BYHWD对改善SCI后前肢运动功能有明显作用，且BH组疗效优于BL组，提示恢复时间相同，疗效可能与剂量成正比。且与第14天比较，第28天时，BL组与BH组大鼠前肢利用率均明显上升，精神状态恢复良好，提示在相同剂量条件下，疗效可能与治疗时间成正比。因此，补阳还五汤治疗对SCI后运动功能恢复效果显著，加快康复速度。
BYHWD具有显著的抗氧化作用，在SCI后，神经元缺血缺氧状态下将会产生和释放大量氧自由基，这些产物可破坏细胞膜，造成细胞损伤从而影响神经细胞的功能[21-23]。因此，抑制自由基产生和清除自由基有利于SCI早期治疗。研究发现，MDA可反映自由基水平，是组织细胞损伤的重要标志。而SOD为氧自由基清除剂，代表机体清除氧自由基的能力[24]。测定MDA、SOD可显示体内自由基的水平，是反映机体抗氧化功能的重要标志[25]。CREB是受多种因素调节靶基因转录的转录因子，其活化后在BDNF的转录调节及信号通路激活中发挥重要作用[26，27]。BDNF主要表达于中枢神经系统，在调控细胞凋亡、促进突触再生和营养神经细胞等方面发挥重要作用[28-30]。研究表明，SCI后神经元轴突受损，轴突损伤可能导致轴突运输能力减弱或消失，进而导致神经元胞体萎缩或死亡，神经元胞体死亡可导致BDNF缺乏，削弱脊髓修复能力[31]。且脑血管疾病临床实验研究证明，氧化应激反应可降低BDNF水平，BDNF水平降低则削弱对氧化应激反应的抑制作用[32-33]。而SCI后，氧化应激与CREB/BDNF信号通路的关系尚无相关研究报道。因此，本实验采用ELISA测定MDA、SOD变化情况反映BYHWD治疗SCI的抗氧化功能变化;采用激光共聚焦技术测定CREB、BDNF在红核神经元中表达水平及定位。共同说明BYHWD治疗SCI过程中，抗氧化作用与CREB/BDNF信号通路的关系。ELISA和激光共聚焦检测结果表明，与对照组比较，SCI组的大鼠血清中MDA水平上升，SOD水平下降，说明SCI造模后的大鼠氧化应激状态明显，抗氧化能力受损严重。且氧化应激状态下，中脑红核区内CREB、BDNF表达水平降低，说明氧化应激抑制CREB/BDNF信号通路，损害红核神经元功能。与SCI组比较，BL组与BH组的大鼠血清MDA水平下降，SOD水平上升，同时中脑红核区内CREB、BDNF表达水平也增加，说明BYHWD干预可削弱氧化应激的影响，抑制和清除氧自由基，激活CREB/BDNF信号通路，提高SCI后大鼠机体的抗氧化能力，而抗氧化能力增强对CREB/BDNF信号通路亦有促进作用，二者相互影响，促进修复神经元功能。与BL组比较，BH组大鼠血清中MDA水平下降，SOD水平上升，脑红核区内CREB、BDNF水平上升明显，说明BYHWD对SCI的抗氧化功能以及抗氧化能力对CREB/BDNF信号通路促进作用可能与BYHWD剂量正相关。实验中各指标测试结果与大鼠行为学测试结果一致，也佐证了本实验研究的假设，说明BYHWD干预对SCI发挥抗氧化作用，激活CREB/BDNF信号通路，促进SCI修复。
综上所述，BYHWD可改善SCI后氧化应激状态，增强机体抗氧化功能，且抗氧化功能与CREB/BDNF信号通路的调节密切相关，二者相辅相成，改善SCI大鼠运动功能，促进SCI修复，且呈剂量依赖性，为临床诊疗提供新的思路。但是BYHWD治疗SCI的最佳剂量范围、周期以及何种化合物在抗氧化功效中发挥重要作用等方面还有待进一步的实验探索[34]。
参考文献
[1]Anwar MA，Al Shehabi TS，Eid AH.Inflammogenesis of secondary spinal cord injury[J].Front Cell Neurosci，2016，10：98.
[2]do Vale Ramos RC，Alegrete N.The role of pharmacotherapy in modifying the neurological status of patients with spinal and spinal cord injuries[J].Rev Bras Ortop，2015，50（6）：617-24.
[3]Jain NB，Ayers GD，Peterson EN，et al.Traumaticspinalcordinjury in the UnitedStates，1993-2012[J].JAMA，2015，313（22）：2236-2243.
[4]Ma L，Mu Y，Zhang Z，et al.Eugenol promotes functional recovery and alleviates inflammation，oxidative stress，and neural apoptosis in a rat model of spinal cord injury[J].Restor Neurol Neurosci，2018，36（5）：659-668. [5]Ahuja CS，Martin AR，Fehlings M.Recent advances in managing a spinal cord injury secondary to trauma[J].F1000Res，2016，5：F1000 Faculty Rev-1017.
[6]Cerqueira SR，Oliveira JM，Silva NA，et al.Microglia response and in vivo therapeutic potential of methylprednisolone-loaded dendrimer nanoparticles in spinal cord injury[J].Small，2016，12（8）：972.
[7]Cong Y，Wang C，Wang J，et al.NT-3 promotes oligodendrocyte proliferation and nerve function recovery after spinal cord injury by inhibiting autophagy pathway[J].J Surg Res，2020，247：128-135.
[8]孫忠人，徐思禹，田洪昭，等.中药及有效成分治疗脊髓损伤的研究概况[J].中华中医药杂志，2020，35（6）：3003-3006.
[9]Motaghinejad M，Motevalian M，Fatima S，et al.The neuroprotective effect of curcumin against nicotine-induced neurotoxicity is mediated by CREB-BDNF signaling pathway[J].Neurochem Res，2017，42（10）：2921-2932.
[10]Feng H，Wang C，He W，et al.Roflumilast ameliorates cognitive impairment in APP/PS1 mice via cAMP/CREB/BDNF signaling and anti-neuroinflammatory effects[J].Metab Brain Dis，2019，34（2）：583-591.
[11]Chen F，Zhou CC，Yang Y，et al.GM1 ameliorates lead-induced cognitive deficits and brain damage through activating the SIRT1/CREB/BDNF pathway in the developing male rat hippocampus[J].Biol Trace Elem Res，2019，190（2）：425-436.
[12]吴万丰，聂慧芳，胡立娟，等.补阳还五汤对缺血性脑卒中气虚血瘀证大鼠肠道菌群及其血浆代谢产物的影响[J].中草药，2021，52（1）：118-128.
[13]Xian-Hui D，Xiao-Ping H，Wei-Juan G.Neuroprotective effects of the Buyang Huanwu decoction on functional recovery in rats following spinal cord injury[J].J Spinal Cord Med，2016，39（1）：85-92.
[14]Hu WJ，Zhang BT，Wu R.Comparison of bulbar conjunctival microcirculation in rabbits of five subtypes of blood stasis syndrome[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2013，33（9）：1261-1266.
[15]Liang H，Paxinos G，Watson C.The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse[J].Brain Struct Funct，2012，217（2）：221-232.
[16]García-Alías G，Truong K，Shah PK，et al.Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries[J].Exp Neurol，2015，266：112-119.
[17]齐英娜，谭明生，王延雷，等.补阳还五汤对大鼠急性上颈脊髓损伤后血小板活化因子的影响[J].中国骨伤，2018，31（2）：170-174.
[18]周彬，范瑜洁，聂颖，等.补阳还五汤联合BMSCs移植对脊髓损伤气虚血瘀证红核神经元的影响[J].湖南中医药大学学报，2019，39（5）：568-572.
[19]王宏江，段晓娜，王鹏，等.游泳训练联合补阳还五汤对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生抑制因子的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2017，39（3）：222-225.
[20]Guo ZP，Huang MN，Liu AQ，et al.Buyang Huanwu decoction up-regulates Notch1 gene expression in injured spinal cord[J].Neural Regen Res，2015，10（8）：1321-133. [21]邵乐，夏相宜，王宇红，等.补阳还五汤精简方对氧化应激损伤血管内皮细胞的保护作用研究[J].湖南中医药大学学报，2019，39（2）：163-167.
[22]孙忠人，徐思禹，李全，等.近5年中药治疗脊髓损伤相关机制研究进展[J].中国中医药信息杂志，2019，26（11）：132-135.
[23]肖玉焕，韩丽，李浩然，等.灵芝多糖防治中枢神经系统疾病的研究进展[J].中草药，2020，51（24）：6391-6395.
[24]Peng Y，Wang Y，Li J，et al.Utility of NSE，ProGRP and LDH in diagnosis and treatment in patients with small cell lung cancer[J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2016，19（9）：590-594.
[25]Sarkar C，Jones JW，Hegdekar N，et al.PLA2G4A/cPLA2-mediated lysosomal membrane damage leads to inhibition of autophagy and neurodegeneration after brain trauma[J].Autophagy，2020，16（3）：466-485.
[26]向芃，谢可炜，姜金星，等.蛋白激酶A部分通过环磷腺苷效应元件结合蛋白信号防止足细胞凋亡[J].上海交通大学学报：医学版，2016，36（1）：6-12.
[27]Tao H，Li X，Wei K，et al.Cyclic AMP prevents decrease of phosphorylated ezrin/radixin/moesin and chloride intracellular channel 5 expressions in injured podocytes[J].Clin Exp Nephrol，2015，19（6）：1000-1006.
[28]Khan IU，Yoon Y，Kim A，et al.Improved healing after the co-transplantation of HO-1 and BDNF overexpressed mesenchymal stem cells in the subacute spinal cord injury of dogs[J].Cell Transplant，2018，27（7）：1140-1153.
[29]Liu B，Li LL，Tan XD，et al.Gadd45b mediates axonal plasticity and subsequent functional recovery after experimental stroke in rats[J].Mol Neurobiol，2015，52（3）：1245-1256.
[30]Wang Y，Li W，Wang M，et al.Quercetin reduces neural tissue damage and promotes astrocyte activation after spinal cord injury in rats[J].J Cell Biochem，2018，119（2）：2298-2306.
[31]曾歡欢，黄英如，李子健，等.大黄素对大鼠急性脊髓损伤后氧化应激和炎症反应的影响研究[J].中国中药杂志，2018，43（9）：1886-1893.
[32]Jing L，Wang JG，Zhang JZ，et al.Upregulation of ICAM-1 in diabetic rats after transient forebrain ischemia and reperfusion injury[J].J Inflamm（Lond），2014，11（1）：35.
[33]Abe Y，Honsho M，Kawaguchi R，et al.A peroxisome deficiency-induced reductive cytosol state up-regulates the brain-derived neurotrophic factor pathway[J].J Biol Chem，2020，295（16）：5321-5334.
[34]刘建春，张红珍，郭文娟，等.补阳还五汤对自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠神经保护作用的机制探讨[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（14）：55-61.
（2020-11-25收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家自然科学基金项目（81302899）——基于cAMP/PKA/RhoA信号通路探讨益气活血法促进BMSCs移植修复脊髓损伤的机制;湖南省自然科学基金项目（2018JJ2289）——补阳还五汤介导钙超载修复脊髓损伤的机制研究;湖南省自然科学基金项目（2019JJ80071）——基于红核蛋白质组学探讨益气活血法修复脊髓损伤的分子机制;湖南省自然科学基金项目（2019JJ50310）——基于mTOR通路探讨益气活血法对脊髓损伤大鼠红核自噬的调节机制;湖南中医药大学中医学一流学科开放基金项目（2018ZYX01）——基于线粒体能量代谢异常探讨益气活血法挽救脊髓损伤凋亡细胞的机制
作者简介：范婷婷（1994.06—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医药修复中枢神经系统损伤，E-mail：[email protected]
通信作者：李亮（1980.02—），男，博士，副教授，研究方向：中医药修复中枢神经系统损伤，中医情志病基础研究，E-mail：[email protected]