论文部分内容阅读
摘 要：猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的各年龄猪以呕吐、带严重恶臭的水样腹泻、体重下降及严重脱水为症状的一种急性传染病。由于猪腹泻病致病因素众多，症状相似，难以通过临床诊断判断病因。近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的应用得到了广泛的应用。本文应用实时荧光PCR技术，检测样品120份，阳性率为16.67%，我区猪传染性胃肠炎的感染形式还是比较严重的。
关键词：猪传染性胃肠炎;实时荧光PCR
猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）引起的以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的传染病，是危害世界养猪业的重要疾病之一。该病由Doyle和Hutchings于1946 年在美国首次报道，几年之内在世界各个国家和地区均有发现。在我国，1956 年该病首先在广东省被发现后，山东、天津、辽宁、甘肃、河北等地陆续发现本病。根据OIE 在2005 年1 月至2012年6月的统计数据显示，我国在2006年、2007年和2009年猪传染性胃肠炎感染总数较少，低于10万头，其他年份则超过10万头，2011 年竟然高达36.6万头，2012年上半年感染数也多达15.9万头。各地抽样阳性率高低不一，但多数地区的猪传染性胃肠炎阳性率在1%～45%之间，个别饲养场甚至高达72.5%[1]。近年来，该病在我国的发病率呈上升趋势，疫区也逐步扩大，并与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻混合感染，给养猪业造成了严重的经济损失。
根据密云地区猪腹泻病发生发展情况，为调查密云地区猪传染性胃肠炎感染情况利用实时荧光PCR技术进行检测。
1 材料
1.1 猪传染性胃肠炎检测试剂盒（实时荧光PCR法）购自北京佰鸥创投生物技术有限公司;动物疫病病毒RNA/DNA提取试剂盒购自苏州天隆生物科技有限公司。
1.2 样本来自密云区4个规模养猪场送检的80份直肠拭子和8个散养户送检的40份直肠拭子，将拭子一起放入装有1.0ml生理盐水的离心管中备用。
2 方法
2.1 提取病毒RNA
从试剂盒中取出真空包装的预封装深孔板，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部。在96孔板的第一列中分别加入20?l蛋白酶K和200?l样本，按移磁珠、裂解、洗涤、洗脱、弃磁珠的自动化提取程序提取。自动化程序结束后，将第六列的洗脱液转移到干净的无核酸酶离心管中。
2.2实时荧光PCR检测
2.2.1 试剂准备：
（1）从-20℃冰箱中取出试剂盒，并取出试剂。
（2）核算当次实验所需反应数，并根据表1反应体系配制当次实验所需要的各种试剂量。
（3）在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，混匀后2000rpm离心10s。按照20?l/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。
（4）盖紧PCR反应管后将其转移至样本准备区。
（5）每管加入样本模版5?l，阳性对照和阴性对照也各加5?l.混匀，记录模板加样顺序，转移至PCR区进行上机。
2.2.2 核酸扩增：
开机预热并检查机器性能，将准备好的PCR反应管放置在仪器样品槽相应位置。按照表2设置仪器核酸扩增相关参数，进行PCR扩增。
2.2.3 判定
试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：Ct值≤30，有明显的指数增长。
（2）阴性对照：Ct值>35或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期。
标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤30，有明显的指数增长。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在30-35之间。应重复检测，如果重复结果Ct值仍在30-35之间，有明显的指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值>35或无Ct值。
3.结果
经对养殖场户送检的120份直肠拭子（4个规模养猪场送检的80份直肠拭子和8个散养户送检的40份直肠拭子）的检测，共检测出阳性样品20份，阳性率16.67%，其中规模养猪场4户，80份样品，阳性样品11份，阳性率13.75%;散养户8户，40份样品，阳性样品9份，阳性率22.50%。
4 讨论
4.1通过对猪传染性胃肠炎病原检测结果分析，经对养殖场户送检的120份直肠拭子（4个规模养猪场送检的80份直肠拭子和8个散养户送检的40份直肠拭子）的检测，共检测出阳性样品20份，阳性率16.67%，目前密云地区整体情况感染情况比较严重。
4.2 传统的PCR技術因其不能对病毒核酸进行精准定量而只能进行定性分析，从而在很大程度上制约了PCR 检测标准的建立。近年来，荧光定量RT-PCR方法因其具有定量准确、敏感性更高（可以检测到几个拷贝/?l的病毒核酸）特异性更好等优点，在TGEV诊断应用中取得了较大进展[2]。
4.3 防控
TGEV以黏膜感染为主，传统的疫苗只能为机体提供被动的保护，而只有通过黏膜免疫产生的直接针对猪传染性胃肠炎感染的IgA 抗体才能为机体提供足够的抵抗病毒感染的保护，因此可使机体产生黏膜免疫反应的口服疫苗将成为猪传染性胃肠炎疫苗研发的新趋势。目前对TGEV尚无有效的治疗方法，在寒冷季节，养殖户采取科学的饲养管理措施是防范猪传染性胃肠炎的基础，一旦发病，要积极采取措施，对症治疗。
参考文献
[1] 王晶.浅析猪传染性胃肠炎在我国的流行趋势[J].猪病防控，2013，10：45-46.
[2] 谢立兰，方六荣，方华为，等.免疫学和分子生物学技术在猪传染性胃肠炎诊断中的应用发展[J].中国兽药杂志，2016，50（2）：56-62.
关键词：猪传染性胃肠炎;实时荧光PCR
猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）引起的以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的传染病，是危害世界养猪业的重要疾病之一。该病由Doyle和Hutchings于1946 年在美国首次报道，几年之内在世界各个国家和地区均有发现。在我国，1956 年该病首先在广东省被发现后，山东、天津、辽宁、甘肃、河北等地陆续发现本病。根据OIE 在2005 年1 月至2012年6月的统计数据显示，我国在2006年、2007年和2009年猪传染性胃肠炎感染总数较少，低于10万头，其他年份则超过10万头，2011 年竟然高达36.6万头，2012年上半年感染数也多达15.9万头。各地抽样阳性率高低不一，但多数地区的猪传染性胃肠炎阳性率在1%～45%之间，个别饲养场甚至高达72.5%[1]。近年来，该病在我国的发病率呈上升趋势，疫区也逐步扩大，并与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻混合感染，给养猪业造成了严重的经济损失。
根据密云地区猪腹泻病发生发展情况，为调查密云地区猪传染性胃肠炎感染情况利用实时荧光PCR技术进行检测。
1 材料
1.1 猪传染性胃肠炎检测试剂盒（实时荧光PCR法）购自北京佰鸥创投生物技术有限公司;动物疫病病毒RNA/DNA提取试剂盒购自苏州天隆生物科技有限公司。
1.2 样本来自密云区4个规模养猪场送检的80份直肠拭子和8个散养户送检的40份直肠拭子，将拭子一起放入装有1.0ml生理盐水的离心管中备用。
2 方法
2.1 提取病毒RNA
从试剂盒中取出真空包装的预封装深孔板，颠倒混匀数次使磁珠重悬，去掉真空包装，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部。在96孔板的第一列中分别加入20?l蛋白酶K和200?l样本，按移磁珠、裂解、洗涤、洗脱、弃磁珠的自动化提取程序提取。自动化程序结束后，将第六列的洗脱液转移到干净的无核酸酶离心管中。
2.2实时荧光PCR检测
2.2.1 试剂准备：
（1）从-20℃冰箱中取出试剂盒，并取出试剂。
（2）核算当次实验所需反应数，并根据表1反应体系配制当次实验所需要的各种试剂量。
（3）在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，混匀后2000rpm离心10s。按照20?l/管分装量将试剂分装至PCR反应管中。
（4）盖紧PCR反应管后将其转移至样本准备区。
（5）每管加入样本模版5?l，阳性对照和阴性对照也各加5?l.混匀，记录模板加样顺序，转移至PCR区进行上机。
2.2.2 核酸扩增：
开机预热并检查机器性能，将准备好的PCR反应管放置在仪器样品槽相应位置。按照表2设置仪器核酸扩增相关参数，进行PCR扩增。
2.2.3 判定
试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：Ct值≤30，有明显的指数增长。
（2）阴性对照：Ct值>35或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期。
标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤30，有明显的指数增长。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在30-35之间。应重复检测，如果重复结果Ct值仍在30-35之间，有明显的指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值>35或无Ct值。
3.结果
经对养殖场户送检的120份直肠拭子（4个规模养猪场送检的80份直肠拭子和8个散养户送检的40份直肠拭子）的检测，共检测出阳性样品20份，阳性率16.67%，其中规模养猪场4户，80份样品，阳性样品11份，阳性率13.75%;散养户8户，40份样品，阳性样品9份，阳性率22.50%。
4 讨论
4.1通过对猪传染性胃肠炎病原检测结果分析，经对养殖场户送检的120份直肠拭子（4个规模养猪场送检的80份直肠拭子和8个散养户送检的40份直肠拭子）的检测，共检测出阳性样品20份，阳性率16.67%，目前密云地区整体情况感染情况比较严重。
4.2 传统的PCR技術因其不能对病毒核酸进行精准定量而只能进行定性分析，从而在很大程度上制约了PCR 检测标准的建立。近年来，荧光定量RT-PCR方法因其具有定量准确、敏感性更高（可以检测到几个拷贝/?l的病毒核酸）特异性更好等优点，在TGEV诊断应用中取得了较大进展[2]。
4.3 防控
TGEV以黏膜感染为主，传统的疫苗只能为机体提供被动的保护，而只有通过黏膜免疫产生的直接针对猪传染性胃肠炎感染的IgA 抗体才能为机体提供足够的抵抗病毒感染的保护，因此可使机体产生黏膜免疫反应的口服疫苗将成为猪传染性胃肠炎疫苗研发的新趋势。目前对TGEV尚无有效的治疗方法，在寒冷季节，养殖户采取科学的饲养管理措施是防范猪传染性胃肠炎的基础，一旦发病，要积极采取措施，对症治疗。
参考文献
[1] 王晶.浅析猪传染性胃肠炎在我国的流行趋势[J].猪病防控，2013，10：45-46.
[2] 谢立兰，方六荣，方华为，等.免疫学和分子生物学技术在猪传染性胃肠炎诊断中的应用发展[J].中国兽药杂志，2016，50（2）：56-62.