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摘要 研究了4种虫生真菌对烟草甲虫的致死效果。结果显示，球孢白僵菌对烟草甲虫的防治效果最好，在103个/mL的孢子浓度下，对烟草甲虫的致死中时为10 d。另外几种真菌对烟草甲虫也有不同程度的感染。经过SPSS软件分析了白僵菌对烟草甲虫致死率与时间剂量的量化关系。
关键词 烟草甲虫；生物防治；虫生真菌；白僵菌
中图分类号 S476.12
烟草甲虫(Lasiderma serricorne)为世界性仓储害虫Ⅲ。我国在20世纪90年代曾对全国贮烟害虫的危害程度进行了调查，每年因虫害引起的质(重)量损失率为1.64％～2％，其中烟草甲虫为害引起的质量损失远大于其他贮烟害虫。烟草甲虫不仅蛀食烟叶，形成孔洞，使烟叶成丝率下降；同时排出大量粪便，留下虫尸，败坏烟叶吸味，品质下降。另外高等级烟叶储存期长，虫损越发严重，储烟害虫的种群密度与烟叶储存期呈直线相关。因此防治烟草甲虫对于烟厂、烟叶复烤厂显得格外重要。
目前，生物防治由于自身的特点而备受人们关注。在防治烟草甲虫的应用研究中，苏云金芽孢杆菌(Bt)对烟草甲有一定的杀虫活性，但效果并不理想。虫生真菌作为经过表皮入侵的杀虫剂有其他杀虫剂所不具备的优点。没有化学杀虫剂的残留毒害，也不像Bt类农药必须经过口腔进入昆虫的肠道才能够发挥作用。选用真菌作为烟叶仓库害虫防治有重要的现实意义。此外，利用真菌进行仓库内害虫防治的报道不多。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株
玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、球孢白僵菌(B.bassiana)、环链拟青霉(Paecilomyces cate-niannulatus)，以上菌株经贵州大学真菌资源研究所鉴定保存。
1．1．2 试验用虫
烟草甲虫采自贵阳卷烟厂南明区烟叶醇化库。
1．1．3 培养基
马铃薯蛋白胨蔗糖(PPSA)培养基：马铃薯200 g切成约1 cm2见方的块，煮沸30 min，过滤除去马铃薯块，定容到1 000 mL，加入20 g蔗糖，5 g蛋白胨，琼脂20 g。121℃灭菌备用。
沙氏(Sabouraud)培养基：葡萄糖20 g，麦芽糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂20 g，水1 000 mL。121口C灭菌备用。
0.05％Tween-80溶液，121℃灭菌备用。无菌蒸馏水，灭菌脱脂棉。
1．1．4 仪器
PQX型多段可编程人工气候箱(宁波东南仪器有限公司制造)，灭菌的15 cm平皿，显微镜，血球计数板，软质毛刷。
1．2 方法
1．2．1 供试菌株的选择
将从各地采集来的4种虫生真菌进行温度筛选。设定了25、30、35℃3个温度梯度的培养箱。将各菌株接种在沙氏培养基的平板上在上述培养箱中培养10 d。通过观察比较各菌株的菌落直径大小来确定试验用菌株。
1．2．2 孢子悬液的制备
各菌株的斜面培养用沙氏培养基，将培养好的各斜面菌株转接到含有PPSA培养基的平板上，28℃培养11 d。倒入适量的0.05％Tween-80溶液，用接种环轻轻刮下孢子到灭过菌的三角瓶中，充分振荡后用2层擦镜纸过濾入灭菌的平皿中，使最高孢子浓度为超过108个/mL备用。4株菌都配制3个梯度浓度。每个浓度3个平行样本。
1．2．3 试虫的选择
把有试虫的取样袋口打开，烟草甲虫会自行爬出，选取大小比较接近具有良好活动性的烟草甲虫为试验试虫。
1．2．4 侵染方法
将烟草甲虫放入具有适量孢子悬液的平皿中2～3 s，立即取出，置于铺有滤纸的培养皿内。每个培养皿内置40头虫，1个脱脂棉球，几片烟叶，30℃，RH75％人工气候箱培养。定期加无菌水保持棉球的湿度。每2天观察死亡率，以长出白色菌丝体的死虫为真菌感染死亡，试验持续10 d。
1．2．5 对照试验
采用Tween-80溶液按照方法1.2.4处理试验用虫，为Tween-80对照组做3个平行。另外做3个不作任何处理的空白样本，观察烟草甲虫的自然死亡率。
1．2．6 数据处理
采用SPSS统计分析软件做回归分析处理。
2 结果与分析
2．1 不同温度下的菌株生长情况
考虑烟仓醇化库的温度范围和虫生真菌的生长温度范围，设定了3个温度梯度，其中在25℃下所有的菌株都生长正常。在30℃下只有来自广西的白僵菌生长正常，其菌落直径(70 mm)和25℃菌落直径(69 mm)差别很小，其他的菌株生长都有不同程度的减弱。35℃下所有菌株都未见生长，培养结束后只有白僵菌存活，其他菌都未存活。
2．2 真菌对烟草甲虫致死效果
在不做任何处理的空白培养皿中甲虫的平均死亡率为6.8％。在吐温对照组中甲虫平均死亡率为19.7％。图1～4显示球孢白僵菌防治烟草甲虫效果较好，另3种真菌感染效果不好。试验用白僵菌菌株采自广西桂林，该菌株耐热性较好，30℃下正常生长，产孢量大。其余几种真菌在30℃下均生长受限制，影响了对甲虫的感染率。
2．3 利用SPSS软件分析4种真菌对烟草甲虫的致
死情况
选择真菌对烟草甲虫的致死率为因变量(y)，孢子浓度(x1)和时间(x2)为自变量，建立回归方程。回归方法选择多重线性回归，得到的结果如表1。根据表1可以初步评价这几种虫生真菌对烟草甲虫的致死效果。当确定真菌孢子浓度则可以估算出烟草甲虫死亡一半数量时所需要的时间，时间值越小说明真菌的防治效果越好。如果选择这几种真菌的孢子浓度数量级都为108，对应回归方程中的变量值为3，那么可以初步得出各菌株对烟甲的致死中时。根据表1可得，球孢白僵菌为10 d，其他几种菌分别为玫烟色拟青霉20.3 d、环链拟青霉21.1 d，布氏白僵菌28 d。
3 讨论
在利用微生物对烟草甲虫的生物防治中，国内外较新的报道都是关于应用苏云金芽孢杆菌防治烟甲，而利用真菌这个潜在的资源防治该虫未见相关报道。本文也只是初步的试验结果离实际应用还有相当距离。来自广西桂林的一株白僵菌虽然显示了较好的应用前景，但也只是在生物测定表现了较好的效果。由于加工好的烟叶在加工过程中经过高温处理是没有甲虫的，只是在贮存醇化的过程中，环境中的甲虫进入了烟箱或烟包造成甲虫危害，因而控制环境中的烟草甲虫种群数量，可以选用白僵菌等虫生真菌。用虫生真菌防治烟草甲虫有一些问题值得关注。(1)虫生菌是否会对烟草品质产生影响，因为虫体带菌很容易将菌污染到烟片上。(2)选育出适合仓储醇化条件(温度较高，湿度较低)的高毒力菌株。(3)合适的真菌剂型。(4)在施用策略上也值得关注，应立足于整个仓储的环境系统来综合考虑防治方案。
关键词 烟草甲虫；生物防治；虫生真菌；白僵菌
中图分类号 S476.12
烟草甲虫(Lasiderma serricorne)为世界性仓储害虫Ⅲ。我国在20世纪90年代曾对全国贮烟害虫的危害程度进行了调查，每年因虫害引起的质(重)量损失率为1.64％～2％，其中烟草甲虫为害引起的质量损失远大于其他贮烟害虫。烟草甲虫不仅蛀食烟叶，形成孔洞，使烟叶成丝率下降；同时排出大量粪便，留下虫尸，败坏烟叶吸味，品质下降。另外高等级烟叶储存期长，虫损越发严重，储烟害虫的种群密度与烟叶储存期呈直线相关。因此防治烟草甲虫对于烟厂、烟叶复烤厂显得格外重要。
目前，生物防治由于自身的特点而备受人们关注。在防治烟草甲虫的应用研究中，苏云金芽孢杆菌(Bt)对烟草甲有一定的杀虫活性，但效果并不理想。虫生真菌作为经过表皮入侵的杀虫剂有其他杀虫剂所不具备的优点。没有化学杀虫剂的残留毒害，也不像Bt类农药必须经过口腔进入昆虫的肠道才能够发挥作用。选用真菌作为烟叶仓库害虫防治有重要的现实意义。此外，利用真菌进行仓库内害虫防治的报道不多。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株
玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、球孢白僵菌(B.bassiana)、环链拟青霉(Paecilomyces cate-niannulatus)，以上菌株经贵州大学真菌资源研究所鉴定保存。
1．1．2 试验用虫
烟草甲虫采自贵阳卷烟厂南明区烟叶醇化库。
1．1．3 培养基
马铃薯蛋白胨蔗糖(PPSA)培养基：马铃薯200 g切成约1 cm2见方的块，煮沸30 min，过滤除去马铃薯块，定容到1 000 mL，加入20 g蔗糖，5 g蛋白胨，琼脂20 g。121℃灭菌备用。
沙氏(Sabouraud)培养基：葡萄糖20 g，麦芽糖5 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂20 g，水1 000 mL。121口C灭菌备用。
0.05％Tween-80溶液，121℃灭菌备用。无菌蒸馏水，灭菌脱脂棉。
1．1．4 仪器
PQX型多段可编程人工气候箱(宁波东南仪器有限公司制造)，灭菌的15 cm平皿，显微镜，血球计数板，软质毛刷。
1．2 方法
1．2．1 供试菌株的选择
将从各地采集来的4种虫生真菌进行温度筛选。设定了25、30、35℃3个温度梯度的培养箱。将各菌株接种在沙氏培养基的平板上在上述培养箱中培养10 d。通过观察比较各菌株的菌落直径大小来确定试验用菌株。
1．2．2 孢子悬液的制备
各菌株的斜面培养用沙氏培养基，将培养好的各斜面菌株转接到含有PPSA培养基的平板上，28℃培养11 d。倒入适量的0.05％Tween-80溶液，用接种环轻轻刮下孢子到灭过菌的三角瓶中，充分振荡后用2层擦镜纸过濾入灭菌的平皿中，使最高孢子浓度为超过108个/mL备用。4株菌都配制3个梯度浓度。每个浓度3个平行样本。
1．2．3 试虫的选择
把有试虫的取样袋口打开，烟草甲虫会自行爬出，选取大小比较接近具有良好活动性的烟草甲虫为试验试虫。
1．2．4 侵染方法
将烟草甲虫放入具有适量孢子悬液的平皿中2～3 s，立即取出，置于铺有滤纸的培养皿内。每个培养皿内置40头虫，1个脱脂棉球，几片烟叶，30℃，RH75％人工气候箱培养。定期加无菌水保持棉球的湿度。每2天观察死亡率，以长出白色菌丝体的死虫为真菌感染死亡，试验持续10 d。
1．2．5 对照试验
采用Tween-80溶液按照方法1.2.4处理试验用虫，为Tween-80对照组做3个平行。另外做3个不作任何处理的空白样本，观察烟草甲虫的自然死亡率。
1．2．6 数据处理
采用SPSS统计分析软件做回归分析处理。
2 结果与分析
2．1 不同温度下的菌株生长情况
考虑烟仓醇化库的温度范围和虫生真菌的生长温度范围，设定了3个温度梯度，其中在25℃下所有的菌株都生长正常。在30℃下只有来自广西的白僵菌生长正常，其菌落直径(70 mm)和25℃菌落直径(69 mm)差别很小，其他的菌株生长都有不同程度的减弱。35℃下所有菌株都未见生长，培养结束后只有白僵菌存活，其他菌都未存活。
2．2 真菌对烟草甲虫致死效果
在不做任何处理的空白培养皿中甲虫的平均死亡率为6.8％。在吐温对照组中甲虫平均死亡率为19.7％。图1～4显示球孢白僵菌防治烟草甲虫效果较好，另3种真菌感染效果不好。试验用白僵菌菌株采自广西桂林，该菌株耐热性较好，30℃下正常生长，产孢量大。其余几种真菌在30℃下均生长受限制，影响了对甲虫的感染率。
2．3 利用SPSS软件分析4种真菌对烟草甲虫的致
死情况
选择真菌对烟草甲虫的致死率为因变量(y)，孢子浓度(x1)和时间(x2)为自变量，建立回归方程。回归方法选择多重线性回归，得到的结果如表1。根据表1可以初步评价这几种虫生真菌对烟草甲虫的致死效果。当确定真菌孢子浓度则可以估算出烟草甲虫死亡一半数量时所需要的时间，时间值越小说明真菌的防治效果越好。如果选择这几种真菌的孢子浓度数量级都为108，对应回归方程中的变量值为3，那么可以初步得出各菌株对烟甲的致死中时。根据表1可得，球孢白僵菌为10 d，其他几种菌分别为玫烟色拟青霉20.3 d、环链拟青霉21.1 d，布氏白僵菌28 d。
3 讨论
在利用微生物对烟草甲虫的生物防治中，国内外较新的报道都是关于应用苏云金芽孢杆菌防治烟甲，而利用真菌这个潜在的资源防治该虫未见相关报道。本文也只是初步的试验结果离实际应用还有相当距离。来自广西桂林的一株白僵菌虽然显示了较好的应用前景，但也只是在生物测定表现了较好的效果。由于加工好的烟叶在加工过程中经过高温处理是没有甲虫的，只是在贮存醇化的过程中，环境中的甲虫进入了烟箱或烟包造成甲虫危害，因而控制环境中的烟草甲虫种群数量，可以选用白僵菌等虫生真菌。用虫生真菌防治烟草甲虫有一些问题值得关注。(1)虫生菌是否会对烟草品质产生影响，因为虫体带菌很容易将菌污染到烟片上。(2)选育出适合仓储醇化条件(温度较高，湿度较低)的高毒力菌株。(3)合适的真菌剂型。(4)在施用策略上也值得关注，应立足于整个仓储的环境系统来综合考虑防治方案。