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【摘要】目的：建立一种测定石杉碱甲片含量的HPLC方法，以期为石杉碱甲片含量的测定提供方法参考。方法：采用HPLC，Kromasil C18柱，甲醇—0. 02%三乙醇胺溶液(体积比60：40)为流动相，检测波长为309 nm，流速为1. 5mL/min，检测波长 250 nm；柱温 30℃。结果：石杉碱甲在1.041~52. 05μg/mL范围内有良好的线性关系，r=0.9996。平均回收率为99.36%，RSD=0.40%。结论：本文所建立的HPLC法操作简便、可靠性强，可用于石杉碱甲片的质量控制及含量测定。
【关键词】石杉碱甲；HPLC；含量测定
石杉碱甲是从石杉科植物蛇足石杉中分离出的生物碱之一，为强效可逆性胆碱酯酶抑制剂[1]。临床证明[2-3]，石杉碱甲对重症肌无力和老年性健忘症、痴呆症具有确切疗效。目前石杉碱甲常用剂型为片剂、注射液[4-5]。为了能够建立一种快速、准确的石杉碱甲片含量测定方法，本文参考有关文献,建立了一种以HPLC法测定石杉碱甲片的含量的方法。现将研究结果报告如下：
一. 材料及方法
（一）仪器与试药
Waters2695-2996型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401)；石杉碱甲缓释片(批号: 090901、090902、090903)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国迪马公司)；其他试剂均为分析纯。
二. 方法与结果
（一）样品液制备
1. 对照品溶液的制备
精密称取石杉碱甲对照品10.41 mg，置100 mL棕色量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，得到0.1041 mg/mL的石杉碱甲对照品贮备液。再精密吸取贮备液3 mL置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，即得。
2. 供试品溶液的制备
取石杉碱甲缓释片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于石杉碱甲0.3mg)，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，即得。
3. 阴性对照液的制备
取处方比例辅料，按石杉碱甲缓释片制备工艺制得空白缓释片，再按上述“2.1.2”的制备方法制备,即得。
（二）色谱条件及系统适应性试验
色谱柱：Kromasil C18柱(250 mmX4.6 mm，5μm)色谱柱；甲醇—0. 02%三乙醇胺溶液(体积比60：40)为流动相；检测波长为309 nm；流速为1.5mL/min；检测波长 250 nm；柱温 30℃；进样量20μL。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液注入色谱仪，在此条件下，理论板数以石杉碱甲峰计应不低于2000，石杉碱甲与其他组分可基线分离，阴性样品不干扰测定。见图1。
（三）方法学考察
1. 线性关系考察
分别吸取一定量的石杉碱甲对照品贮备液，加流动相稀释成石杉碱甲质量浓度为1.041、2.082、3.123、5.205、10.41、52.05μg/mL的溶液，依次进样20μL，每个浓度测定3次以上。以石杉碱甲对照品溶液质量浓度(Q)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：A=31940Q-210.08，r=0.9996。结果表明石杉碱甲质量浓度在1.041~52.05μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2. 精密度试验
取供试品溶液(批号090901)20μL连续测定6次，其峰面积RSD=1. 2%，表明仪器精密度良好。
3. 稳定性试验
取供试品溶液(批号090901)在0、2、4、8、12、16、24 h分别进样20μL，结果峰面积的RSD=1.1% (n=7)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
4.重复性试验
取同一批号(批号090902)样品6份，每份约相当于石杉碱甲0. 3 mg，精密称定，记录峰面积，RSD=0.7%。
5. 加样回收试验
精密称取同一批号石杉碱甲缓释片(090903)粉末适量(约相当于石杉碱甲0.15mg)，分别置10mL量瓶中，再分别加入石杉碱甲对照品贮备液1. 5 mL，加流动相适量，超声使溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，计算回收率，结果见表1。石杉碱甲平均回收率为99. 36%，RSD是0. 40%。
表 1 回收率试验结果
（四） 样品测定
取石杉碱甲缓释片3批，计算样品中石杉碱甲含量,结果表明石杉碱甲缓释片的平均含量是标示量的99. 5%，RSD为1.4%。
三. 讨论
本文采用HPLC，Kromasil C18柱，甲醇—0. 02%三乙醇胺溶液(体积比60：40)为流动相；检测波长为309 nm；流速为1. 5mL/min；检测波长 250 nm；柱温 30℃，所得峰形较好，主峰、杂质峰能达到基线分离,可获得较高的理论塔板数、分离度、拖尾因子(1.035)达到要求。总之，本文所建立的HPLC法操作简便、可靠性强，可用于石杉碱甲片的质量控制及含量测定。
参考文献：
[1] 吴婷,张军,储继红,等. 高效液相色谱法测定石杉碱甲缓释贴片中石杉碱甲的含量[J]. 中国药物与临床. 2011(09).
[2] 魏振满,丁晋彪,胡琳,等. 石杉碱甲缓释片在健康人体的生物等效性[J]. 中国临床药理学杂志. 2012(01) .
[3] 魏振满,丁晋彪,胡琳,等. 饮食对石杉碱甲缓释片药代动力学的影响研究[J]. 中国药业. 2011(17).
[4] 谭培汉. 石杉碱甲缓释片的制备及体外释放度的测定[J]. 药品评价. 2007(03).
[5] 袁经权，周小雷，王硕，等.HPLC测定不同产地与不同部位千层塔中石杉碱甲和石杉碱乙含量[J].药物分析杂志，2012（9）.
【关键词】石杉碱甲；HPLC；含量测定
石杉碱甲是从石杉科植物蛇足石杉中分离出的生物碱之一，为强效可逆性胆碱酯酶抑制剂[1]。临床证明[2-3]，石杉碱甲对重症肌无力和老年性健忘症、痴呆症具有确切疗效。目前石杉碱甲常用剂型为片剂、注射液[4-5]。为了能够建立一种快速、准确的石杉碱甲片含量测定方法，本文参考有关文献,建立了一种以HPLC法测定石杉碱甲片的含量的方法。现将研究结果报告如下：
一. 材料及方法
（一）仪器与试药
Waters2695-2996型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。石杉碱甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100243-200401)；石杉碱甲缓释片(批号: 090901、090902、090903)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国迪马公司)；其他试剂均为分析纯。
二. 方法与结果
（一）样品液制备
1. 对照品溶液的制备
精密称取石杉碱甲对照品10.41 mg，置100 mL棕色量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，得到0.1041 mg/mL的石杉碱甲对照品贮备液。再精密吸取贮备液3 mL置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，即得。
2. 供试品溶液的制备
取石杉碱甲缓释片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于石杉碱甲0.3mg)，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，即得。
3. 阴性对照液的制备
取处方比例辅料，按石杉碱甲缓释片制备工艺制得空白缓释片，再按上述“2.1.2”的制备方法制备,即得。
（二）色谱条件及系统适应性试验
色谱柱：Kromasil C18柱(250 mmX4.6 mm，5μm)色谱柱；甲醇—0. 02%三乙醇胺溶液(体积比60：40)为流动相；检测波长为309 nm；流速为1.5mL/min；检测波长 250 nm；柱温 30℃；进样量20μL。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液注入色谱仪，在此条件下，理论板数以石杉碱甲峰计应不低于2000，石杉碱甲与其他组分可基线分离，阴性样品不干扰测定。见图1。
（三）方法学考察
1. 线性关系考察
分别吸取一定量的石杉碱甲对照品贮备液，加流动相稀释成石杉碱甲质量浓度为1.041、2.082、3.123、5.205、10.41、52.05μg/mL的溶液，依次进样20μL，每个浓度测定3次以上。以石杉碱甲对照品溶液质量浓度(Q)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：A=31940Q-210.08，r=0.9996。结果表明石杉碱甲质量浓度在1.041~52.05μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2. 精密度试验
取供试品溶液(批号090901)20μL连续测定6次，其峰面积RSD=1. 2%，表明仪器精密度良好。
3. 稳定性试验
取供试品溶液(批号090901)在0、2、4、8、12、16、24 h分别进样20μL，结果峰面积的RSD=1.1% (n=7)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
4.重复性试验
取同一批号(批号090902)样品6份，每份约相当于石杉碱甲0. 3 mg，精密称定，记录峰面积，RSD=0.7%。
5. 加样回收试验
精密称取同一批号石杉碱甲缓释片(090903)粉末适量(约相当于石杉碱甲0.15mg)，分别置10mL量瓶中，再分别加入石杉碱甲对照品贮备液1. 5 mL，加流动相适量，超声使溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，计算回收率，结果见表1。石杉碱甲平均回收率为99. 36%，RSD是0. 40%。
表 1 回收率试验结果
（四） 样品测定
取石杉碱甲缓释片3批，计算样品中石杉碱甲含量,结果表明石杉碱甲缓释片的平均含量是标示量的99. 5%，RSD为1.4%。
三. 讨论
本文采用HPLC，Kromasil C18柱，甲醇—0. 02%三乙醇胺溶液(体积比60：40)为流动相；检测波长为309 nm；流速为1. 5mL/min；检测波长 250 nm；柱温 30℃，所得峰形较好，主峰、杂质峰能达到基线分离,可获得较高的理论塔板数、分离度、拖尾因子(1.035)达到要求。总之，本文所建立的HPLC法操作简便、可靠性强，可用于石杉碱甲片的质量控制及含量测定。
参考文献：
[1] 吴婷,张军,储继红,等. 高效液相色谱法测定石杉碱甲缓释贴片中石杉碱甲的含量[J]. 中国药物与临床. 2011(09).
[2] 魏振满,丁晋彪,胡琳,等. 石杉碱甲缓释片在健康人体的生物等效性[J]. 中国临床药理学杂志. 2012(01) .
[3] 魏振满,丁晋彪,胡琳,等. 饮食对石杉碱甲缓释片药代动力学的影响研究[J]. 中国药业. 2011(17).
[4] 谭培汉. 石杉碱甲缓释片的制备及体外释放度的测定[J]. 药品评价. 2007(03).
[5] 袁经权，周小雷，王硕，等.HPLC测定不同产地与不同部位千层塔中石杉碱甲和石杉碱乙含量[J].药物分析杂志，2012（9）.